SN_T 2206.11-2014化妆品微生物检验方法 第11部分：金黄色葡萄球菌 多重实时荧光PCR法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2206.11-2014化妆品微生物检验方法第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法Determination of microorganism in cosmetics--Part 11 :Multiplex fluorescent real-time PCR methodfor Staphylococcus aureus2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电话4006982159梦 SN/T 2206.11---2014前言SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分：第1部分：沙门氏菌；第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；一第3部分：肺炎克雷伯氏菌；-第4部分：链球菌；一第5部分：肠球菌；--第6部分:破伤风梭菌;~第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原；一-第8部分：白色念珠菌；-第 9部分:胆汁酸耐受革兰氏阴性菌;一第10部分：金黄色葡萄球菌 PCR法;一第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法；-第12部分：绿脓杆菌 PCR法；一一第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌。本部分为SN/T2206的第11部分。本部分按照GB/T 1.1--2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分主要起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。主部分主要起草人：许红岩、刘宁、王颖、尹伟力、鲁闽、段效辉、方绍庆、曹鹏、耿金培。1 SN/T 2206.11—2014化妆品微生物检验方法第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光 PCR 法1范围SN/T2206的本部分规定了化妆品中金黄色葡萄球菌的多重实时荧光PCR检测方法。本部分适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的定性检测。7，规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB 7918.1化妆品微生物标准检验方法总则GB7918.5化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌SN/T 1193基因实验室技术要求3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1Ct 值 Cycle threshold Ct每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语Tag:水生栖热菌（Thermus aguaticu）FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)HEX:6-羧基-2’,4,4,5’,7,7-六氯荧光素(5-hexachloro-fluorescein)BHQ:黑洞淬灭基(Black hole quencher)4检测方法4.1方法原理加人多对引物和与模板 DNA匹配的、两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针进行 PCR反应。PCR每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光信号的增加量可1 SN/T 2206.11—2014以间接地体现样品模板DNA的目的基因的扩增量。样品的模板DNA进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对化妆品中金黄色葡萄球菌进行实时荧光PCR检测。4.2设备和材料4.2.1实时荧光 PCR仪。4.2.2冰箱:-20℃～4℃。4.2.3高速台式离心机（最高转速12000r/min以上）。4.2.4微量移液器和灭菌吸头:10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。4.2.5离心管:1.5 mL。4.2.6恒温水浴锅。4.2.7天平：感量0.01g。4.2.8均质器。4.2.9灭菌锥形瓶:500 mL、254.2.10生化培养箱：温度36℃±1℃4.2.11高压灭菌器。4.3培养基和试剂除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂;水为灭菌双蒸水所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.3.1712008 中级水的规格水：应符合 GB/T 6682-4.3.2SCDLP 液体培养基。4.3.377.5%氯化钠肉汤。4.3.4Taq DNA 聚合酶。4.3.5dNTP:dATP,dTTP,dCPTris-HCl(pH值为4)4.3.610XPCR 缓冲液:200 mmc200mmol/L氯化钾(KCl)，15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。4.3.7DNA提取液：称取O.chelex 100 粉果加人100mL永菌蒸馏水中，摇匀。1S4.3.8三氯甲烷。4.3.9酚-三