NY_T 2311-2013黄曲霉菌株产毒力鉴定方法.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2311—2013黄曲霉菌株产毒力鉴定方法Identification method of the toxigenicityof Aspergillus flavus strains2013-08-01实施2013-05-20发布中华人民共和国农业部发布 NY/T2311--2013前言本标准按照GB/T1.1-·2009给出的规则起草本标准由农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：李培武、李冉、黄家权、丁小霞、白艺珍、周海燕、雷永、唐晓倩。T NY/T2311—2013黄曲霉菌株产毒力鉴定方法1范围本标准规定了黄曲霉菌株产毒力鉴定方法，本标准适用于黄曲霉菌株产力鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注月期的版本适用于本文件。凡是不注口期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理对待检黄出霉菌株进行微生物培养.通过镜检初步对黄曲霉菌进行鉴定。再对黄曲霉菌株进行产毒培养.采用高效液相色谱法检测其黄曲霉毒素含量，确定菌株产毒力。4试剂与材料除非另有规定.所用试剂均为分析纯或生化试剂试验用水应符合GB/T6682中·级水的规格。4.1燕糖：化学纯。4.2硫酸铵[（NH.）.SO1：化学纯。4.3磷酸二氢钾（KHP()）：化学纯。4.4硫酸镁（MgS()·7H.()：化学纯。4.5硼酸钠（NaB.(·10H.)：化学纯。4.6铝酸铵［（NH,）。Mo.()2·4H.（：化学纯。4.7乙二胺四乙酸二钠（CjHN.Na.O）：化学纯。4.8硫酸亚铁（FeSO，·7H:))：化学纯。4.9硫酸铜（CuS()，·5Hz()：化学纯。4.100硫酸锰（MnSO，·H())：化学纯。4.11石硫酸锌（ZnS()，·7H（)）：化学纯。4. 12硝酸钠（NaNO）：化学纯。4.13氯化钾（KCI)：化学纯。4.14琼脂：水分22%.灰分3%。4.15氯化钠（NaCI)：化学纯。4.16甲醇（CH：()H）：化学纯。4.17次氯酸钠溶液：有效氯≥10%。4.18苯一乙睛：取2ml.乙睛加人98mL苯4.1970%甲醇水溶液（含1%NaCI)：称取4g(精确至0.01g)NaCI溶解到30ml.水中，再加人甲醇定容到100ml4.201%吐温水：999ml水中加人1ml.吐温-20，混匀后121℃高压灭菌20min，冷待用。1 NY/T2311—20134.210.1%次氯酸钠：1ml.次氯酸加水定容至100ml。4.22黄曲霉毒素B、黄曲霉毒素B:、黄曲霉毒素G，和黄曲霉毒素G标准（AFB:、AFB、AFGI、AFG）样品：纯度≥98%。4.23黄曲霉毒素标准储备液：准确称取黄曲霉毒素B,、黄曲霉毒素B:、黄曲霉毒素G，和黄曲霉毒素G²标准样品.用苯一乙睛（1.18）配制成0.100mg/ml.的储备液4.24黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取黄曲霉毒素B,、黄曲霉毒素B:、黄曲霉毒素G：和黄曲霉毒素G?标准储备液.用苯：乙腈（4.18）溶液稀释成混合标准工作液（AFB与AFG：2μg/L、5ug/L、10 μg/ 1.、15 μug/ L、20 μg/ L;AFB.与 AFG: 0. 6 μg/1.、1. 5 μg/ L、3 μg/ 1.、4. 5 μg/ I.、6 μg/ L)。4.25察氏培养基：准确称取硝酸钠3.00g，磷酸氢二钾1.00g，硫酸镁0.50g，氯化钾0.50g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30.00g，琼脂20.00g.加水定容至1000ml。加热溶解，三角瓶50ml.分装后121℃灭菌20min。4.26察氏培养基平板：灭菌后察氏培养基冷却至60℃左右，倒人15ml，至无菌培养Ⅲ（内径9cm），冷却后无菌密封，4℃保存（一周内使用）。4.27产毒培养基：准确称量蔗糖50g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾10g，硫酸镁4.09g，硼酸钠0.0007g钼酸铵0.0005g，乙二胺四乙酸二钠0.193g,硫酸亚铁0.0128g,硫酸铜0.0005g，硫酸锰0.0001g.硫酸锌0.03g，琼脂粉10g.加水加热溶解，定容至11.,调整pH=5.7,121℃高压灭菌20min。5仪器设备5.1高效液相色谱仪.配FIID检测器。5.2分析天平：感量0.01g。5.3高速均质器（12000r/min）。5.4具塞离心管：10ml.。5.5250ml.分液漏斗。5.6具塞二角瓶：150ml.。5.7恒温恒湿培养箱。5.8显微镜。5.9生物安全柜。5.10高压火菌锅。5.11恒温摇床。5