SN_T 4749-2017犬传染性肝炎检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4749-2017犬传染性肝炎检疫技术规范Quarantine protocol for infectious canine hepatitis2017-12-01实施2017-05-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局W3星香草社 SN/T 4749--2017前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局本标准主要起草人：熊炜、张舒亚、王艳、张强、蒋静、王巧全、李健、黄忠荣 SN/T 4749--2017犬传染性肝炎检疫技术规范1范围本标准规定了犬传染性肝炎 PCR 和 Real-time PCR 检测的操作方法。本标准适用于犬传染性肝炎流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述犬传染性肝炎（infectious canine hepatitis，ICH)是由犬传染性肝炎病毒（infectious canine hepatitisvirus,ICHV)引起的急性败血性传染病，以马鞍型高热.严重血凝不良，肝脏受损，角膜混浊等为主要临床特征。本病发生没有季节性，各种年龄和品种的犬均可感染，但以断乳后至1岁以内的犬多发，6周龄～7周龄的犬发病率和致死率最高。ICHV还可引起熊、狐的脑炎。犬传染性肝炎病毒(ICHV)又称为I型犬腺病毒（Canine adenovirus type I,CAV-I)，ICHV 无囊膜，核衣壳直径为 70 nm～80 nm，呈二十面体立体对称，其基因组为线状双链DNA，长约30kb～31kb.有30个开放读码框，基因组大小在不同的血清型存在差异。4试剂和材料4.1Taq酶及 10 倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5 U/μl，20 ℃ 保存,避免反复冻融。4.2dNTP:含 dATP、dGTP、dCTP.dTTP 各 10 mmol/L,-20 ℃保存。4.3PCR引物：浓度为20μmol/I，扩增基因片段大小为510 bp,其序列如下：弓物(ICHVF):5GCA AGC AGT TCA ACC TCC AGC 3;引物(ICHVR):5GGT CCA GTC CAT AGA GTT ACA G 3。4.4Real-time PCR的引物和探针：引物浓度为20 umol/L，探针浓度为10 μmol/L，其序列如下：上游引物(TICHVF):5TCC CTG CCA ACA CTA CAA ACC TA 3;下游引物(TICHVR):5GGT AAA GCT CCA CCC TCT GAA TC 3。TaqMan 探针(ICHV-P):5CCA TTC CTG CCA GAA ATT GGG CC 3’,其 5’端和 3’端分别标记FAM和 TAMRA。4.5DNA分子量标准：适合检测分子量大小100 bp～1000bp间的DNA片段，-20℃保存。4.6生理盐水：常温保存（见A.1）。4.710%十二烷基硫酸钠：常温保存（见A.2）。4.8蛋白酶K贮备液：4℃保存（见A.3）。4.95XTBE电泳缓冲液：常温保存（见A.4）。 SN/T 4749—20174.10EB溶液：4℃保存（见 A.5）。4.116倍加样缓冲液：4℃保存（见A.6）。5仪器与设备5.1JPCR仪：ABI 9700或相同功能 PCR仪。5.2荧光PCR仪：ABI7700、ABI7500或相同功能荧光PCR仪。5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度13000g。5.4水平电泳仪。5.5凝胶成像系统。6病料的采集及处理采集的样品包括病犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器宫。将待检组织或粪便加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检。口鼻腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。ICHV阳性对照样品和阴性对照样品采用同样的方式与待检样品平行进行处理，待检备用。７DNA 抽提取上清液465μL，加人25μL10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h；加人等量的饱和酚溶液500μL，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；加人等量的酚；三氯甲烷；异戊醇（25：24：1），振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液：再加人等量的三氯甲烷：异戊醇（24：1），振荡混匀20 s，12000g离心5mi