SN_T 4615-2016国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4615---2016国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法Detection method for human infected avianinfluenza A (H7N9) virus by real time RT-PCR at frontier ports2016-08-23发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4615-—2016前言本标准按照GB/T 1.1一-2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：胡孔新、马雪征、张丽萍、孙肖红、刘健。1 SN/T 4615--2016国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT~PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸人感染H7N9禽流感病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，人感染H7N9禽流感实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员携带人感染H7N9禽流感病毒的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求WS 233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒)种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令（第45号))3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1人感染 H7N9 禽流感病毒Human:infected avian influenza A(H7Ng)正粘病毒科所属的禽流感病毒的二种亚型,该病毒为新型重配病毒。由于禽流感病毒与人流感病毒存在受体特异性差异，虽然偶尔会有某些 H7病毒（H7N2、H7N3、H7N7)感染人类的报告，一般认为禽流感是不易感染给人的，但经过近年来流感病毒的基因重组，些既往在禽间传播的高致病性禽流感亚型和新形成的禽流感亚型已可以突破种系感染人类。3.2实时荧光 RT-PCR real time fluorescence RT-PCR在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,利用Taq 酶的5-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接受到荧光信号。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ct值表示。4缩略语下列缩略语适用于本文件。4.1RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction) SN/T 4615--20164.2Ct 值 Cycle threshold循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4.3FAM:6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein)一种荧光报告基团。4.4BHQ1 :黑洞淬灭基团(Black Hole Quencher 1)一类非荧光淬灭基因。5 检测对象出人境口岸发现的可疑病例。6实验室生物安全要求生物安全遵循以下要求：个人防护遵循GB19489；实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全二级（BSL-2)实验室的生物安全要求；使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理；疑似人感染H7N9禽流感病毒的材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》。A实验室仪器设备本方法使用的主要仪器如下：荧光 PCR仪;超净工作台；二级生物安全柜；高压灭菌锅;低温高速离心机：最大离心力20000g；漩涡振荡器；冰箱:4℃、20℃和一70℃;移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1 mL;恒温水浴锅；无菌注射器。8 试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：标本保存液:pH 7.4～7.6 的 Hanks 液或 Earles平衡盐溶液,并含 5%牛血清白蛋白,万古霉素 100 μg/mL，阿米卡星 30 μg/mL和制霉菌素 40 U/mL。商品化系统如 BD Universal ViralCulturetteTM Transport System.2 SN/T 4615—2016核酸提取试剂：用德国 Qiagen 公司 QIAamp Viral RNA Kit 提取病毒核酸!’；实时荧光 RT-PCR 试剂:Ag-Path-IDTM One ste