SN_T 4406-2015竹花叶病毒的检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4406—2015竹花叶病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of Bamboo mosaic virus2015-12-04发布2016-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准竹花叶病毒的检疫鉴定方法SN/T 4406—2015*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数18千字2016年7月第一版2016年7月第一次印刷印数1—1100*书号：155066·2-30317定价16.00元 SN/T 4406—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、蔡伟、林双庆、陈雅菁、李敏、张永江、金晶、高芳銮、吴祖建一 SN/T 4406—2015竹花叶病毒的检疫鉴定方法1范围本标准规定了竹花叶病毒检测的程序和方法。本标准适用于进出境竹子上竹花叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理中文名称：竹花叶病毒学名：Bamboo mosaic virus，缩写：BaMV分类地位：线形病毒科（Alphafleriviridae），马铃薯X病毒属（Potervirus）。竹花叶病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。竹花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。4仪器设备、用具及试剂4.1仪器设备高速冷冻离心机、PCR仪、酶标仪、凝胶成像分析系统等。4.2用具各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20μL、10μL、2μL）、PCR反应管、Eppendorf离心管（1.5mL）、研钵等。4.3试剂间接ELISA试剂见附录B、RT-PCR试剂见附录C。5检测与鉴定5.1抽样抽样方法按照SN/T2122中规定执行。5.2间接ELISA具体方法见附录B。1 SN/T 4406-20155.3RT-PCR具体方法见附录C。结果判定与记录66.1结果判定结果判定如下：当间接ELISA检测结果为阳性，且RT-PCR检测结果为阳性时，则判定为检出BaMV，否则判定为未检出BaMV当RT-PCR检测结果呈阳性，且测定的序列为BaMV序列，则判定为检出BaMV，否则判定为未检出BaMV。6.22结果记录记录各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。7样品的保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。2 SN/T4406—2015附录A（资料性附录）竹花叶病毒的背景资料A.1寄主范围已报道的自然寄主为竹子，包括绿竹、蓬莱竹、长枝竹、泰山竹、麻竹、孟宗竹、箭竹等。A.2 病害症状BaMV侵染竹子均为系统性感染，一般在叶片引起黄化或褐化的条斑症状，以嫩叶上尤为明显，在竹笋与竹茎横剖面上可观察到褐色到黑色的斑点，上下延伸后在纵剖面上则呈现短钉状病斑，导致竹笋组织硬化，感病后期或数年后，造成竹笋产量显著减少。A.3分布地区主要分布于中国台湾、巴西、澳大利亚及夏威夷。A.4传播途径主要通过机械传播。可通过带毒竹子种苗进行远距离传播。A.5粒体形态病毒粒体为长丝状，大小约490nmX15nm，如图A.1。图A.1BaMV病毒粒体(LapierreH和SignoretP,2004)A.66病毒基因组基因组为正义单链RNA，全长约6366bp。2 SN/T 4406-2015附录B（规范性附录）间接ELISAB.1试剂B.1.1包被缓冲液（pH9.6）碳酸钠（Na2CO：）1.59 g碳酸氢钠（NaHCO：）2.93 g叠氮化钠（NaN3）0.2 g加人蒸馏水900mL，用HCl调节pH值到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。B.1.2磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4)8.0 g氯化钠(NaCI)0.2 g磷酸二氢钾（KH2PO4）磷酸氢二钠（Na2HPO