SNT 1699.2-2006猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1699.2—2006猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程Protocol of direct immunofluorescent test for porcine epidemic diarrhea2006-08-16实施2006-01-26 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1699.2—2006前 言SN/T 1699分为三部分：猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程；猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程；猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程。本部分为SN/T1699的第2部分。本部分的附录 A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：罗琼、梁刚、林志雄、李力施。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1699.2—2006猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程1.范围SN/T1699的本部分规定了猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验的操作方法。本部分适用于猪流行性腹泻的诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1699的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6822分析实验室用水规格和试验用法3缩略语下列缩略语适用于SN/T1699的本部分。3. 1PED猪流行性腹泻。A仪器设备荧光显微镜、冰冻切片机、眼科镊子、载玻片、盖玻片、染色缸。5试验材料5. 1 0. 01 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法见A.1.1，或按诊断试剂说明书配制。5.2甘油缓冲盐水配制方法见A.1.2，或按诊断试剂说明书配制。5.30.2%伊文思蓝溶液配制方法见A.1.3，或按诊断试剂说明书配制。5.4荧光抗体经结合了异硫氰酸荧光黄(FITC)的免抗PED病毒抗体。由指定单位提供，按说明书要求，保存使用。5.5 水本部分使用水符合GB/T6822中二级水的规格。5.6被检样品采取一段长约 10 cm 病死猪的空肠,样品应无菌采取，且无腐败。5.7 阳性样本指定单位提供。5.8阴性样本指定单位提供。 SN/T 1699. 2—20066　操作方法6.1标本的制作将取得的病死猪的空肠样本，放于洁净培养Ⅲ中，加人少量PBS液，用眼科剪子剖开肠管在PBS液中轻轻漂洗，除去肠腔内容物，取洁净的肠管为样本。6.1.1肠上皮细胞洗脱物涂片取一段洁净样本，放人离心管或反应管,加 3mL～5 mL PBS液,以细玻璃棒搅拌1 min～3 min,待PBS液混浊后，取出肠管，以1000r/min离心沉淀5min，弃去上清液。用铂耳钩取肠上皮洗脱物，于洁净的载玻片上涂片，每个肠管样本涂两张以上玻片。自然风于后，浸于丙酮缸内，室温条件下固定15min,取出自然风干，制成肠上皮细胞洗脱物涂片标本。6. 1.2 肠组织冰冻切片另取段洁净样本，剪成0.2cm～0.8 cm长的肠段，立即用眼科镊子将肠段直立在冰冻台上，待肠管冻结后，将肠管切片，贴于洁净的载玻片生，风干，浸于芮酮缸内，室温条件下固定15min，制成肠管切片标本。6.2染色按荧光抗体说明书标定的工作效价，用0.2%伊文思蓝稀释荧光抗体。将稀释后的荧光抗体直接滴加到固定的肠上皮细胞洗脱物涂片标本及肠管切片标本±-以覆盖满为宜。放湿盒中于37℃温箱感作30 min。6.3漂洗从温箱中取出后，将染片用.PBS.液漂洗三次，每次3.min，随后用蒸馏水浸泡三次，每次3min。6.4　封固标本漂洗后，风干，滴加甘油缓冲盐水，加盖玻片封固。6.5镜检置荧光显微镜下，用520nm~530nm绿色滤光片，在490nm~495nm紫外光下，观察各个已染色的标本，必要时进行显微照植。结果判定镜检判定时，应注意荧光物质的部位及颜色，观察标本细胞浆，细胞浆外或胞核内的荧光不能判为阳性。用异硫氰酸荧光黄标记的荧光抗体，在荧光显微镜下发出癌绿色荧光，凡呈暗绿色或黄色的荧光，为非特异性荧光。7.1 阳性A细胞浆内见有弥漫性或颗粒性亮绿色的荧光时,判定为阳性7.2阴性细胞浆内未见有弥漫性或颗粒性亮绿色的荧光时，判为阴性。2 SN/T 1699.2—2006附录A(规范性附录)试剂配制与器材处理A. 1 试剂配制A. 1. 1 0.01 moI/L pH7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)磷酸氢二钠(Na2HPO·12H,O)8.70 g磷酸二氢钠(NaH²PO4·2H O)0.89 g氯化钠(NaCI)22.80 g以上试剂应选用