SNT 2519-2010贝类中星状病毒检测方法 普通CPR和实时荧光CPR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2519—2010贝类中星状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法Determination of astrovirus in shellfish-Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR method2010-03-02 发布2010-09-16 实施中华人民共和国发布金层线81815号查国家质量监督检验检疫总局数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准贝类中星状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法SN/T 2519-2010中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16¥印张1１字数 24 千字2010年5月第一版2010年5月第一次印刷印数 1—1 600*书号：155066·2-20847 SN/T 2519—2010言前本标准的附录 A 为规范性附录,附录 B和附录 C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、国家认监委认证认可技术研究所、国家质量监督检验检疫总局标准法规中心、北京金纳信生物科技有限公司。本标准的主要起草人：曾静、魏海燕、杨光、范爱红、饶红、江明、聂棱、张西萌。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2519-—2010贝类中星状病毒检测方法普通 PCR和实时荧光 PCR方法1范围本标准规定了贝类中星状病毒的普通 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类中星状病毒的检测;食物中毒样品中星状病毒的检测可参照使用。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室　生物安全通用要求SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1术语和定义3. 1. 1星状病毒astrovirus属于星状病毒科,星状病毒属。病毒颗粒呈球形,无包膜,直径为 28 nm～30 nm。病毒基因组为单股正链 RNA,长 6.8 kb,3端有 polyA尾。3.1.2Ct 值I cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阐值时所经历的循环数。3. 1.3纳米磁珠 magnetic nanoparticles利用纳米技术将磁性材料如Fe:O4制成纳米微粒,大小介于原子簇与一般微粒子之间（直径一般小于100 nm）,MNP的量子尺寸效应使之展现出许多特有的性质，如比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强等，为生物和医学应用研究提供了更加科学的手段。3.2缩略语3.2. 1DEPC diethyl pyrocarbonate焦碳酸乙二酯。3.2.2MNP magnetic nanoparticles纳米磁珠。 SN/T 2519---20103.2.3PEG polyethylene glycol聚乙二醇。3.2. 4RNase ribonuclease核糖核酸酶或 RNA 酶。3. 2.5bp base pair碱基对。方法原理4. 在偏碱性甘氨酸缓冲液中通过物理研磨的方式对贝类消化组织进行均质，并通过温育促进病毒颗粒的释放，利用 PEG8000 沉降病毒。然后一方面可以采用 Trizol-reagent 或其他等效裂解液提取总RNA,并进一步使用包被了 oligo-dT 的磁珠与星状病毒 RNA-3端的 polyA 特异结合，纯化病毒RNA;另一方面也可采用纳米磁珠直接从 PEG沉降后的病毒悬液中富集病毒粒子,吸附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释放出病毒 RNA,无需进一步纯化。上述两种提取病毒 RNA 的方法分别称为 GPTT法(Glycine-PEG-Trizol-oligo·dT)和纳米磁珠法。最后利用普通 RT-PCR和实时荧光 RT-PCR 进行检测。5‘试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合~GB/T 6682中一级水的要求。5.1匀浆缓冲液：甘氨酸缓冲液(pH9.6),见附录A.1.1。5.2PEG8000溶液：见附录A.1.2%5.3裂解液：Trizol-reagent 或其他等效产品。5.4 三氯甲烷。5.5 异丙醇。5.6　无RNase去离子水：见附录lA..1.35.775%乙醇