SN_T 3674-2013凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3674—2013凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Impatiens necrotic spot virus2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3674-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局本标准主要起草人：李曼、丁元明、张巧萍、寸东义、邓裕亮、曹云华、杜宇、刘忠善、和捷。 SN/T 3674—2013凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗和苗木中凤仙花坏死斑病毒的检疫与鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理中文名：凤仙花坏死斑病毒学 名:Impatiens necrotic spot virus缩写:INSV分类地位：布尼亚病毒科（Bunyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospovirus）。INSV 的血清学特性和分子生物学特征(参见附录 A)是检疫鉴定该病毒的主要依据。4仪器设备、用具和试剂4.1仪器电子天平（0.0001g）、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、超低温冰箱、微波炉、酶标仪、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、实时荧光PCR仪。4.2用具可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、酶联板和研钵等。4.3试剂去离子水或蒸馏水应符合GB/T6682中的三级水的要求，超纯水应符合GB/T6682中一级水的要求。所用试剂为INSVDAS-EIISA检测试剂盒、Trizol、DEPC、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇，M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。除有特殊说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。没有 INSV DAS-ELISA检测试剂盒的，血清学试剂的配制方法见附录B,分子生物学试剂配制见附录C。1 SN/T 3674-20135检疫鉴定方法5.1双抗夹心酶联免疫吸附检测(DAS-ELISA)将制备的样品汁液用INSVDAS-ELISA试剂盒检测，每个样品设两个重复。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为样品抽提缓冲液。具体操作步骤见附录B。5.2分子生物学检测注：实际检测中，可视实验室条件选用以下两种方法中任意种进行5.2.1巢式 RT-PCR 检测提取样品的总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，再将第一次PCR产物稀释后作为模板进行第二次PCR，最后对二次·PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超纯水。具体操作步骤见附录C。5.2.2实时荧光 RT-PCR 检测提取样品的总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，然后以icDNA为模板进行实时荧光PCR检测。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超纯水。具体操作步骤见附录D。6 结果记录与判定6.1结果记录DAS-ELISA检测记录各检测反应孔的光密度值，巢式RT-PCR检测有电泳结果照片，实时荧光RT-PCR应有扩增曲线等原始数据。6.2结果判定6.2.1样品经DAS-ELISA检测为阴性时，判定样品为凤仙花坏死斑病毒阴性。6.2.2样品经DAS-ELISA检测为阳性、巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定样品不携带凤仙花坏死斑病。6.2.3样品经DAS-ELISA检测为阳性、巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性时，判定样品携带凤仙花坏死斑病毒。7样品保存经检验确定携带风仙花坏死斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。种子保存在干燥条件下，其他的组织样品（如叶片等)保存在一20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。2 SN/T 3674--2013附录A（资料性附录）凤仙花坏死斑病毒相关资料A.1　名称中文名：凤仙花坏死斑病毒学名:Impatiens necrotic spot.W11缩‧写:INSV分类地位：布尼亚病毒科（Bunyaviridae