SN 1314-2003水貂阿留申病对流免疫电泳操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T貂阿留申病对流免疫电泳操作规程Protocol of counter immunoelectrophoresis for mink aleutian disease2004-02-01实施2003-08-18 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1314—2003前言本标准电泳操作方法参考农业部《动物检疫操作规程》（1988年版）的检疫方法，并制定了样品加样前处理方法。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：赖平安、张鹤晓、刘艳华。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1 SN/T 1314—2003水貂阿留申病对流免疫电泳操作规程1范围本标准规定了水貂阿留申病对流免疫电泳试验操作规程。本标准适用于用对流免疫电泳方法检测进、出境水貂阿留申病抗体。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3材料准备3.1仪器与器材3mm厚100mmX45mm玻璃板；电压0V～300V,电流0mA～50mA的电泳仪;宽100mm的电泳槽;直径3mm的打孔器100 μL微量可调移液器及配套吸头；塑料毛细采血管。3.2 pH8.5~8.6 的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.31 g三羟甲基氨基甲烷6.005 g叠氮钠0.2 g二级水(符合GB/T6682)1 000 mL各成分加人适量二级水（符合GB/T 6682)中溶解后，用盐酸将pH值调至8.5～8.6,最后用二级水（符合GB/T6682)定容至1000mL。3.3琼脂糖国产或进口电泳用分析纯琼脂糖。3.4抗原由阿留申病毒国际标准毒株Utah-1的猫肾传代细胞培养物制备而成。由指定单位提供。3.5血清3.5.1阳性血清：由指定单位提供。3.5.2阴性血清：由指定单位提供。3.5.3被检血清：用塑料毛细管在貂趾尖采血，将管两端烧融封口，放20℃～30℃环境静置1h，再放4℃冰箱18 h～20h,析出血清后加入0.5mL或1.5mL离心管中，3000r/min离心5min,取上清液备用。4操作规程4.1铺板取3mm厚100mm×45mm水平无划痕的玻璃板，将油污洗净后，平放于水平桌面上，用10mL吸管吸取已溶化并冷却到70℃左右的0.8%琼脂糖缓冲液，均匀地铺于玻璃板上，厚度为3mm，在铺板时在玻璃板四周夹上档板，待冷却凝固后备用，限当日用完。1 SN/T 1314—20034.2打孔将已凝固的琼脂糖凝胶板放于孔径3mm、孔距4 mm的打孔模型图纸上（见附录A)打孔，然后用大头针将孔内琼脂糖挑出。4.3封底打孔完毕，将玻璃板置酒精灯外焰上加热，使各孔间琼脂糖凝胶与玻璃板间的间隙封住，置室温冷却30 min，备用。4.4加样待检血清按编号顺序用移液器逐份加到靠阳极的血清孔内，以加满不溢出为度，每份样品换一吸头；抗原用移液器加在靠阴极的抗原孔内，以加满不溢出为度。同时，每板设阳性和阴性血清对照。4.5电泳将电泳槽两侧加满电泳缓冲液(以电泳槽内的标线为准)，将加样完毕的琼脂糖凝胶板平放于电泳槽架上，血清孔置阳极，以双层滤纸或单层纱布（宽度11cm为宜，长度以能连接凝胶板和电解缓冲液为准)搭桥，一端放在琼脂糖板的边缘,不要盖住加样孔，一端放人电泳槽内的电泳缓冲液中。将抗原孔端接于电泳仪阴极，血清孔一端接于阳极。核对电极与样品孔间的正确连接后，接通电源。4.6电泳条件4.6.1电压:90V～100V,勿超过100V,否则易使凝胶板于裂而影响沉淀线观察。4.6.2电流：在控制电压前提下，电流随着版面大小而变化。4.6.3电泳时间:30 min～60 min。5 结果判定电泳结束后，关闭电源，取出琼脂板在阳光下以黑色为背景，观察沉淀线，判定结果。5.1 阳性判定在抗原和血清孔之间稍偏向血清孔一侧形成一条直的或稍弯曲的十分清晰的灰白色沉淀线者，即判阳性（十）。若在抗原与血清孔之间出现模糊不清的沉淀线而难以判定时，可用2%氯化钠水溶液浸泡琼脂板15 min～18min，或放电泳槽内或置 4℃冰箱放一湿盒内，次日再判定。5.2阴性判定在血清孔和抗原孔之间无任何沉淀线，或虽在血清孔近旁出现较宽呈云雾状的弧形沉淀带，但其外侧缺乏另条直的灰白色沉淀线者，判为阴性（一），此为某些貂血清含脂蛋白之故。有时被检血清孔出现拖尾现象，此乃轻微溶血