SNT 2345-2009松树脂溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2345—2009松树脂溃疡病菌检疫鉴定方法Quarantine identification of Fusarium circinatum Nirenberg ODonnell2010-01-16-实施2009-07-07发布中华人民共和国(发布国家质量监督检验检疫总局纺 SN/T 2345-2009前言本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D和附录 E均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国江苏出人境检验检疫局起草本标准主要起草人：李百胜、廖太林、纪睿、吴翠萍、吴新华、安榆林。本标准是首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2345—2009松树脂溃疡病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中松树脂溃疡病菌（Fusarium circinatum Nirenberg ＆ODonnell)的检疫鉴定方法。本标准适用于来自松树脂溃疡病菌发生国家和地区的松属（Pinus spp.）、黄杉属（Pseudotsugaspp.)及其他松树脂溃疡病菌寄主植物的种子、苗木及木材的人境检疫鉴定。2原理2.1$分类地位松树脂溃疡病菌(Fusarium circinatum Nirenberg ODonnell,异名:F. subglutinans sp. pini)属真菌界（Fungi)，半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），瘤座孢.目（Tuberculariales），瘤座孢科（Truberculariaceae），镰刀菌属（Fusarium）。松树脂溃疡病菌有性阶段为Gibberella circinataNirenberg ODonnell,属于藤仓赤霉(G.fujikuroi)种群复合体(species complex)中的一个种。2.2　寄主在自然界,该病原菌主要为害松属、黄杉属植物。其中以在美国南方种子园内的湿地松（P.elli-oti）、加利福尼亚州的辐射松（P.radiata）、加州沼松（P.muricata）、瘤果松（P.attenuata）以及南非的展叶松(P.patula)上为害较为严重。松树脂溃疡病菌可以通过寄主植物的木材、苗木或其上的传播介体、球果、种子以及土壤传播。分布国家和地区参见附录 A。2.3鉴定原理松树脂溃疡病菌的形态(参见附录 B图 B.1、图 B.2)、寄主范围、传播途径、为害症状以及分子生物学特征是该病菌检疫鉴定的主要依据。3仪器、用具和试剂3.1仪器、用具-PCR仪;-凝胶电泳设备；离心机；-涡旋器；恒温水浴锅；凝胶成像系统；其他常规实验室设备、器具。3.2 试剂蔗糖、葡萄糖、琼脂、蛋白陈、磷酸二氢钾、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、五氯硝基苯（PCNB）、地茂散杀菌剂、三唑酮、氨卞西林、利福平、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸（EDTA）、次氯酸钠、无水乙醇、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、乙酸铵（NH4Ac）、氯化镁（MgCl²）二甲基亚砜(DMSO)、dNTP、Taq DNA聚合酶、溴化乙锭(EB）、液氮。4检疫鉴定方法4.1．现场检验检查原木、板材或苗木表面，有无流脂、溃疡斑。用子、锯子或刀片分别横向、纵向切开；观察木材1 SN/T 2345--2009是否充满树脂；如有虫孔，检查虫孔内是否产生分生孢子和携带传播媒介（参见附录C）。观察种子有无变质症状。将可疑症状样本带回实验室作进一步检验。4.2实验室检验4.2.1分离培养 种子取变质种子，用75%酒精浸泡15s，再用1%次氯酸钠浸泡1min，无菌水冲洗3次，置于灭过菌的吸水纸上晾干。将上述种子置于选择性培养基上（参见附录D)，25℃光照培养。将产生的可疑病菌分别转至 PDA培养基上进一步培养,直至产生病菌繁殖器官。种苗取发病种苗的主根和侧根，用75%酒精消毒1min，无菌水冲洗3次，置于灭过菌的吸水纸上。切取根部病健交界处3 mm～5 mm天小的组织,置于选择性培养基上25 ℃光照培养。将产生的可疑病菌分别转至PDA培养基上进一步培养，直至产生病菌繁殖器官。树干（枝）、木材及球果取发病树枝、干、球果或充满树脂木质部的病健交界处，用1.6%的次氯酸钠溶液表面消毒 1 min，无菌水冲洗,接种于选择性培养基上，25℃光照培养。将产生的可疑病菌分别转至PDA培养基上进一步培养,直至产生病菌繁殖器官。媒介昆虫将虫冷冻杀死,接种于选择性培养基上；25℃光照培养。将产生的可疑病菌分别转至 PDA培养基上进一步培养,直至产生病菌繁殖器官。病原菌纯化培养分离产生的真菌无性阶段经形态观察确定为镰刀菌属后，进行病菌分生孢子的单孢分离，进一步纯化培养。4.2.2