NY_T 2841-2015猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2841-2015猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法Method of detecting transmissible gastroenteritis virus by RT-nPCR2015-10-09发布2015-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2841--2015前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会归口（SAC/TC181）。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、东北农业大学、河南农业大学、河南牧业经济学院。本标准起草人：邵卫星、魏荣、李晓成、李一经、黄耀华、魏战勇、徐耀辉、吴发兴、张志、刘爽、董亚琴、孙映雪、李卫华、王树双、黄保续I NY/T2841—-2015猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法1范围本标准规定了检测猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR方法的技术要求。本标准适用于检测疑似感染猪传染性胃肠炎病毒的猪的新鲜粪便、小肠组织及肠内容物和细胞培养物中的猪传染性胃肠炎病毒的核酸，可作为猪传染性胃肠炎的辅助诊断方法和细胞培养物中猪传染性胃肠炎病毒的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3缩略语下列缩略语适用于本文件：AMV：禽成髓细胞瘤病毒avianmyeloblastosisvirusRT-nPCR：反转录-巢式聚合酶链式反应reversetranscriptase-nested polymerase chainreactionRNA：核糖核酸ribonucleic acidDEPC:焦碳酸二乙酯diethypyrocarbonatePBS：磷酸盐缓冲液（配方见附录A.1）phosphate-buffered salinebufferTaq酶：TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerasedNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸deoxyribonucleosidetriphosphatesbp:碱基对base pair4试剂除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的灭菌双蒸水或超纯水。提取RNA所用试剂均须使用无RNA酶水配制，分装的容器需无RNA酶。4.1磷酸盐缓冲液：配方见附录A.1。4.2RNA提取试剂：Trizol LS。4.3氯仿（警告：危险）。4.4异丙醇。4.575%的乙醇。4.6DNA分子量标准：DL2000。4.7AMV反转录酶及反应缓冲液。4.8dNTPs Mixture。4.9RNA酶抑制剂（40 U/μL)。4.10rTaq mix。4.11反转录及PCR扩增引物：见附录B。 NY/T 2841—20154. 122无RNA酶超纯水。4.1331.5%琼脂糖：配方见A.34.14电泳缓冲液(TAE)：配方见A.4。4.15样品处理液：配方见A.2。4.16阳性样品：参见C.1。4.17[阴性样品：参见C.2。5仪器设备5.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000×g以上。5.2PCR扩增仪。5.3核酸电泳仪和水平电泳槽。5.4恒温水浴锅。5.52℃～8℃冰箱和-18℃冰箱。5. 6 微量加样器(0. 5 μL～10 μL,2 μL～20 μL,20 μL～200 μL,100 μL～1 000 μL)。5.7组织研磨器或研钵。5.8凝胶成像系统(或紫外透射仪)。6样品的采集、运输和处理6.1样品采集和运输宜采集腹泻急性期的小肠或新鲜粪便。采集小肠（5cm～10cm)或新鲜粪便（5g～10g），置于样品密封袋中，在低温保存箱中送实验室，应确保样品到实验室时附带的冰袋未完全融化；如不能及时检测，应将样品置于低于一18℃冰箱中保存。6.2样品处理6.2.1小肠样品取1cm～3cm小肠组织，用剪刀剪碎，加入10mL的PBS。用组织研磨器研磨后反复冻融3次，经12000r/min离心5min，取上清备用。6.2.2粪便样品取0.5g～1.0g新鲜粪便，加入800uL样品处理液。反复冻融3次，经12000r/min离心5min，取上清备用。6.2.3细胞培养物样品取细胞培养物300μL～500μuL，无需任何处理，备用。7RNA的提取下列方法任选其一。在提取RNA时，应设立阳性对照样品和阴性对照样品，按同样的方法提取RNA。RNA的提取宜在无RNA污染的外排式生物安全柜中进行。a）Trizol法。按照生产厂家提供的操作说明进行，步骤如下：取250μL上清作为待提取样品。加人750μLTrizol，振荡混匀后，室温放