SN_T 3562-2013国境口岸疟原虫PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3562-2013国境口岸疟原虫PCR检测方法PCR detection on Plasmodium at frontier ports2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局话400698235、刮涂层查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸症原虫PCR检测方法SN/T 3562--2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 www. spc. net. cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张0.5字数 4 千字2013年8月第一版2013年8月第一次印刷印数 11600*书号：155066·2-25807 SN/T 3562-2013前 言-2009给出的规则起草。本标准按照GB/T1.1FL本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所。本标准主要起草人：田桢干、聂维忠、方筠、陈勤、章琪、陆晔、郑斌、曹敏、贾巍、何宇平、李平、李强、卢钟山。1 SN/T 3562—2013国境口岸疮原虫PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸疟原虫标本采集、送检、PCR检测和结果判定。本标准适用于国境口岸疟原虫的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489实验室　生物安全通用要求SN/T1300国境口岸蚊类监测规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1疟原虫 Plasmodium属于真球虫目（Eucoccidida）、疟原虫科（Plasmodidae）、疟原虫属（Plasmodiun），是疮疾（malaria）的病原体。寄生人体的疟原虫有间日症原虫（Plasmodium vivaα）、恶性症原虫（Plasmodium falciparum）、三日疟原虫（Plasmodium malariae)和卵形疟原虫（Plasmodium ovale)4种。3. 2巢式 PCR 方法nested PCR一种特殊的 PCR,是使用两对 PCR 引物进行扩增完整 DNA 片段的方法。巢式 PCR 在第一对PCR引物的扩增片段的基础上，利用第二对引物（又称巢式引物)进行扩增，该引物可结合在第一次PCR产物内部，使得第二次 PCR扩增片断短于第一次扩增，提高了扩增特异性。4实验室要求实验室结构和设施、安全操作规程、安全设施及个体防护应符合GB19489的要求。5 对象5.1国境口岸发现的疑似感染症原虫病人标本。5.2来自疮疾流行区的蚊虫标本。5.3其他需检验的标本。 SN/T 3562—20136标本的采集、保存和运送6.1标本的采集采血部位常在手指末端，也可选耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75%乙醇棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺人取血部位1mm～2mm，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴,并制备滤纸血。6.2标本的运送运送过程保持4℃以下温度条件，闻冰盒包装，运至具的地后及时罕游箱保存。滤纸血晾干后密封干燥保存，可在常温下运送。6.3标本的保存标本置4℃可存放2周～3周，长期贮存应在二20℃或以下6.4蚊虫标本的采集、运送和保存蚊虫标本的采集、运送和保存按照SN/T1300执行。７ PCR 检测7.1试验器材与试剂7. 1. 1试验器材试验器材主要有：a)PCR 仪;b)普通冰箱、80℃低温冰箱；c)手动移液器:0.5 μL～10 μ、10 r100μL、10p μl~T 000 μLjd)旋涡振荡仪;e)高速台式离心机；f)电泳仪;凝胶成像系统。g)7. 1.2主要试验试剂主要试验试剂有：DNA 提取试剂;a)b)Taq DNA 聚合酶;疟原虫扩增引物，见表1；c)表1巢式PCR检测疮原虫种类的引物及其扩增产物长度产物长度引物反应轮次bprPLU5:5-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-31 100第一轮(属特异性引物)rPLU6:5-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-32 SN/T 3562--2013表1 (续)产物长度引物反应轮次bprFAL1 :5′-TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT-3205恶性痣原虫rFAL2 : 5′-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3rVIV1 : 5-CGCTTCTAGCTTAATC