SNT 2328-2009化妆品急性毒性的角质细胞试验.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2328---2009化妆品急性毒性的角质细胞试验Cosmetics acute toxicity of keratinocyte cytotoxicity test2009-07-07 发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2328--2009前言本标准附录 A、附录 B和附录 D是规范性附录,附录 C是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、秦瑶、邱璐、郑秋月。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2328—2009化妆品急性毒性的角质细胞试验1范围本标准规定了化妆品急性毒性的角质细胞试验方法的基本原理、试验准备、试验过程、结果和报告。本标准适用于化妆品原料和成品细胞毒性作用的筛选和检测。本标准适用于预测啮齿类动物急性经口毒性试验的开始剂量，可作为毒性试验的一部分，结合其他试验用于受试物质毒性的整体评价。本标准也可作为制药、农业和工业受试物质，食品添加剂和接触材料，以及其他污染物的毒性测定参考方法。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1希尔函数‧hill function关于受试物浓度与反应关系的包含4个变量的S型对数数学模型。Top--BottomY- Bottom +.Tr+-10dogicgoxHislopeY是反应，X是剂量（或浓度)对数,Bottom是最小反应，Top是最大反应，logIC5o是反应剂量或浓度在最高(Top)和最低(Bottom)中间时的对数,Hiislope 表示曲线的倾斜度。2. 2人角质细胞 human keratinocyte, HKC角质细胞是构成人体表皮的主体细胞，是一种可含成角蛋申的细胞，体内呈分层生长排列；体外分离的角质细胞来源于包皮或胸腹部等处皮肤组织。2. 320%致死浓度 IC20在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制20%的受试物浓度，2. 4半数致死浓度IC50在一定条件下使 HKC细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。2. 580%致死浓度IC80在一定条件下使 HKC细胞生长和活力抑制80%的受试物浓度。3基本原理本标准采用正常人角质细胞,应用中性红摄取(NRU)细胞毒性试验检测受试物的细胞毒性。体外培养的正常哺乳动物细胞不断地分裂增生，毒性物质不论其作用位点和机制如何，都会干扰细胞的分裂增殖过程，导致细胞生长速率下降和数量减少。培养中的正常细胞经受试物暴露后，细胞毒性表现为浓度依赖性的中性红摄取降低，据此可以得出有关细胞完整性受损和生长抑制等作用的信息。中性红(NR)是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。活细胞具有结合和连接中性红染料的特点。外源性物质作用引起的细胞膜表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变，1 SN/T 2328-2009引起溶酶体膜脆性增高及其他的变化，并逐渐不可逆。这些变化导致细胞吸收和连接NR的能力下降。这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细胞。角质细胞 NRU细胞毒性检测程序是基于这一原理设计的种反映细胞存活/活力变化的检测方法。4试验准备除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，本标准列出了特殊试验材料的建议厂家，如有证据证明，可以使用替代品。4.1人角质细胞人角质细胞可用原代或细胞系：a）人永生化角质细胞系HaCaT：商品化细胞系，可从美国标准生物品收藏中心（American TypeCulture Collection,ATCC)获取;b）正常人角质细胞（Normal Human Keratinocyte，NHK）：商品化细胞系，可从美国BioWhittaker 公司(CloneticsCC-2507或 CC-2607)获取;c）原代人角质细胞（Primary Human Keratinocyte）：来源于儿童皮肤（包皮环切术）或成人皮肤，需符合有关伦理学规定。由实验室自行制备。4.2细胞培养基4.2.1人角质细胞无血清基础培养基商品化购置或实验室自行配制，可从美国BioWhittaker公司KBM(Keratinocyte Basal Medium）或GIBCO 公司 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)获取。4.2.2人角质细胞培养基补充试剂配制角质细胞完全培养基需补充以下活性成分：重组人表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）、氢化可的松（Hydrocortisone）、庆大霉素、两性霉素和牛垂体提取物（Bovine Pituitary Extr