NY_T 2634-2014棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.01B 61NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2634—2014棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法Identification genuineness of cotton varieties using SsR markers2014-10-17发布2015-01-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2634—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（合肥）。本标准主要起草人：杨剑波、路曦结、何团结、陆徐忠、郑曙峰、张小娟、倪金龙，I NY/T2634—2014棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法1范围本标准规定了棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法本标准适用于陆地棉品种真实性鉴定2规范性引用文件必不可少。B日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件尚应用是用文件，其最新版本(BLISHING件。凡是不注日期的引文件物种子险验规GB/T3543.2农作扦样作物种子？GB/T 3543.作物种RESEARCAGB 4407.析实验GB/T 668用水规格S3术语和定Y下列术语和定3. 1品种真vayiegenuineness文任记供检品和分王F己带型上的一致H性。1CENT33. 2inpleSSR分子eat是指由几承发单元的多达复；由于基本单元重复次数的不座位两侧保列设计一对特异引物来扩增SSR序A3. 3标准样品standard sample特性的样品经权威机构认定认证的代表已知品种特行有性繁殖勿而言，一一般为种子。3. 4带型patterns某核心引物扩增特定单株DNA得到的条带类型。4原理根据SSR序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR技术扩增和电泳分析，获得样品各单株的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品就单株间的带型逐一进行差异比较和判读分析，进行棉花品种真实性鉴定。5试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。1 NY/T2634—20145.1β-巯基乙醇。5.2异丙醇。5.3剥离硅烷。5.4四甲基乙二胺(TEMED)。5.5TaqDNA聚合酶。5.6PCR反应缓冲液(10×Buffer）。5.725mmol/L氯化镁溶液（MgCl2）。5.81mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(Tris-HCl)称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0,加水定容到1000mL。在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.910mol/L氢氧化钠溶液（NaOH)在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。5.100.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA一Na2）（pH8.0)称取187.6g乙二铵四乙酸二钠(EDTA一Na2)加入800mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.11DNA抽提液分别称取69.3g葡萄糖，20.0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），1.0g二乙基二硫代氨基甲酸（DIECA)溶于500mL水中，然后分别加人100mL1mol/L的Tris-HCl溶液、10mL0.5mol/L的EDTA一Na2溶液（pH8.0），定容到1000mL。在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.12DNA裂解液分别称取81.7g氯化钠（NaCI），20.0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），20.0g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，1.0g二乙基二硫代氨基甲酸（DIECA)溶于500mL水中，然后分别加人100mL1mol/L的Tris-HCl溶液，4mL0.5mol/L的EDTA一Na2溶液（pH8.0），定容到1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.13苯酚+氯仿+异戊醇混合液体积比为25+24十1。5.14氯仿+异戊醇混合液体积比为24十1。5.1570%乙醇量取70mL无水乙醇，加水定容到100mL。5.16SSR引物工作液引物序列见附录A，将引物配制成终浓度均为10umol/L的上、下游引物工作液5.17dNTPs混合溶液浓度为2.5mmol/L的dNTPs混合溶液5.185×三羟甲基氨基甲烷/硼酸电泳缓冲液（5×TBE）分别称取50.0gTris，27.5g硼酸溶于500mL水中，加人10mL0.5mol/L的EDTA一Na2溶液（pH8.0），定容到1000mL