SN_T 4876.2-2017DNA条形码方法 第2部分：检疫性断眼天牛.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4876.2--2017DNA条形码方法第2部分：检疫性断眼天牛Method for DNA barcode-Part 2 :Quarantine Tetropiumspp.2017-11-07发布2018-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T4876.2—2017言前SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；一第2部分：检疫性断眼天牛；第3部分：检疫性卷蛾；一第4部分：检疫性高梁属；一第5部分：曼陀罗属；本部分为SN/T4876的第2部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本部分主要起草人：徐梅、钱路、吴晶、禹海鑫、叶兼菱、季琴琴、朱林娟、杨晓军、郑斯竹、安榆林。 SN/T4876.2—2017DNA条形码方法第2部分：检疫性断眼天生1范围SN/T4876的本部分规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。本部分适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2013暗褐断眼天牛检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA条形码DNAbarcode一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2凭证标本voucherspecimenDNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。3.3COI基因COIgene线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromecoxi-dasesubunitI），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。4检疫性断眼天牛基本信息中文名：断眼天牛学名：Tetropiumspp.分类地位：鞘翅目Coleoptera，叶甲总科Chrysomeloidea，天牛科Cerambycidae，断眼天牛属Tetropium断眼天牛是一类重要的蛀干害虫，该属中的绝大多数种类均严重危害针叶木，偶尔也可危害阔叶木。其主要分布于欧亚大陆及美洲，在古北区分布有7种，北美有6种。我国检疫性断眼天牛种类主要有暗褐断眼天牛（T.fuscum）、棕翅断眼天牛（T.cinnamopterum）、落叶松断眼天牛（T.gabrieli）、施氏 SN/T4876.2—2017断眼天牛（T.schwarzianum）、铁杉断眼天牛（T.uelutinum）、小红棕断眼天牛（T.parvulum）等。5方法原理根据断眼天牛的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性断眼天牛进行鉴定。6仪器用具和试剂6.1仪器常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平（感量1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、冰箱、微量移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、PCR管（0.2mL，0.5mL）。6.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。提取液A(含1%SDS,5ommol/L提取液B3mmol/LKAc，Tris·Cl,25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA）、5mol/L醋酸钾（KAc）、Tris饱和酚、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、液氮、10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ExTaq聚合酶、引物（见表1）、DL2000Marker、琼脂糖、溴化乙锭（EB)。7DNA条形码鉴定7.1核酸的制备采用磁珠法提取基因组DNA。提取步骤为：将酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用双蒸水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，将组织进行研磨，加入180uL裂解液及20L蛋白酶K，55℃温浴，使得组织完全裂解。再加人200μL缓冲液、200μL无水乙醇及20μL磁珠，使DNA吸附到磁珠上，使用500μLWashBuffer进行除杂，之后加人20μL的ElutionBuffer将DNA溶解，得到基因组DNA溶液，于一20℃保存。7.2DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DN