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SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.11—2016入境环保用微生物菌剂检测方法第11部分：雅致小克银汉霉Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection--Part 11 :Cunninghamella elegans2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.11—2016前言SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分。一第1部分：地衣芽孢杆菌；-第2部分：短小芽孢杆菌；第 3部分·巨大芽孢杆菌;-第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；第6部分：金黄色葡萄球菌；第7部分：沙门氏菌；第8部分：志贺氏菌；第9部分：致泻大肠埃希氏菌；第10部分：淡紫拟青霉；第11部分：雅致小克银汉霉；第12部分：哈茨木霉；第13部分：黄孢原毛平革菌；第14部分：焦曲霉；第15部分：解淀粉芽孢杆菌；第16部分：类产碱假单胞菌；第17部分：恶臭假单胞菌。本部分为SN/T4624的第11部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、沈阳药科大学。本部分主要起草人：李俊环、王秋艳、徐慰倬、贺瑞、张新元、王芳 SN/T 4624.11--2016入境环保用微生物菌剂检测方法第11部分：雅致小克银汉霉1范围SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉的形态学鉴定、实时荧光 PCR检测方法。本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基3.1实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。3.2马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)：见附录 A 中 A.1。3.3马铃薯-葡萄糖液体培养基：见 A.2。3.4CTAB缓冲液:见 A.3。3.5蛋白酶 K。3.6Tris 饱和酚。3.7三氯甲烷。3.8异戊醇。3.9异丙醇。3.10TE缓冲液(pH 8.0):见 A.4。3.1170%乙醇。3.12溴化乙锭。3.13DNA分子量标记：1000 bp DNA ladder。3.143琼脂糖。3.1550XTAE缓冲液(pH 8.5):见 A.5。3.16Real Master Mix(2.5X,含 ROX 内参染料)。3.1720 X Probe Enhancer Solution.3.18液氮。4主要设备和材料4.1电子天平（感量0.01g）。4.2恒温培养箱:25℃士1℃1 SN/T 4624.11-—20164.3恒温振荡器：25℃±1℃。4.4恒温水浴锅。4.5台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。4.6PCR超净工作台。4.7实时荧光PCR仪。4.8微量移液器和灭菌吸头：10 μl、20μL、200 μl、1000 μL。4.9高压灭菌锅。4.10电泳仪装置。4.11核酸/蛋白分析仪。4.12凝胶成像系统。4.13陶瓷研钵。4.14无菌培养皿：直径90mm。4.15灭菌三角烧瓶:500 mL,250 mL。4.16接种棒、镍铬丝。4.17Eppendorf管和 PCR反应管。4.18显微镜：物镜10×～100×。5样品制备、培养5.1无菌操作取1g（mL)样品加人到100mL无菌水中混匀，移取1环菌液连续划线接种5个PDA琼脂平板，25℃±1℃条件下培养3d～5d,观察琼脂平板上的菌落特征。取样过程中，在样品旁边放置1个 PDA平板作为空白对照。5.2挑取单菌落划线接种在PDA平板上，25℃士1℃条件下培养3 d～5d,得到纯化的菌株，进行形态学鉴定。5.3挑取符合形态学特征单菌落转人马铃薯-葡萄糖液体培养基中，25℃±1℃条件下180r/min振荡培养 3 d～5 d,获得菌丝体。6鉴定特征6.1培养性状雅致小克银汉霉生长迅速，接种PDA平板，25℃培养3d后菌落直径为80mm左右，高10mm～15mm左右，表面长绒絮状,灰黑色，反面暗黄或深灰黑色。6.2形态特征囊轴倒梨形,项囊直径5.2μm～12.5μm，小孢囊黑褐色，球形至椭圆形，表面粗糙，直径 6.5μm～8.3 μm 或(8.0 μm~9.3 μm)X(6.8 μm~~8.2 μm)。7分子生物学检测7.1模板 DNA 的提取7.1.1直接提取法取5.3中菌液