SN_T 4728-2016椰子败生类病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4728—2016椰子败生类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Coconut tinangaja viroid2016-12-12发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O SN/T4728—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出入境检验检疫局。本标准起草人：李伟东、潘英文、刘福秀、韩玉春、敖苏，一 SN/T4728—2016椰子败生类病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了椰子败生类病毒的检疫鉴定方法本标准适用于棕榈科植物种果、苗木及植株中椰子败生类病毒的检疫和鉴定。2规范性引用文件2下列文件对于本文件的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样33椰子败生类病毒的基本信息学名：Coconut tinangaja viroid缩写：CTiVd中文名：椰子败生类病毒分类地位：马铃薯纺锤形块茎类病毒科Pospiviroidae，椰子死亡类病毒属Cocadviroid。椰子败生类病毒的其他信息参见附录A。4方法原理椰子败生类病毒的基因组为环状或线状，核酸为单链核糖核酸（ssRNA）。根据该类病毒引发的植株症状、基因组RNA序列等进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小或Ct值进行结果判定。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备PCR仪、荧光定量PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、电子分析天平（感量为0.1mg）等。5.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。RT-PCR检测试剂（见附录B)、荧光定量PCR检测试剂（见附录 C)。6取样和制样在检疫现场观察植株受害的症状，CTiVd为害症状描述参见A.3。对疑似类病毒症状的植株，每株1 SN/T4728—2016采集症状叶片0.2g～1g，单独制样；没有症状的植株或无法观察症状的植物产品按照SN/T2122规定抽取代表性样品，每份0.2g~1g，单独制样。1检测鉴定RT-PCR凝胶电泳检测7.1RT-PCR凝胶电泳检测见附录B。7.2荧光定量PCR检测荧光定量PCR检测见附录C。8结果判定样品经RT-PCR检测为阳性，或荧光定量PCR检测为阳性，即可判定样品中存在CTiVd。9样品保存9.1样品保存检测结果为阳性的植物样品保存于一20℃或者一80℃冰箱中。保存样品做好登记和标识工作。9.2结果记录与资料保存完整的实验记录要包括：样品的来源种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员图片。的签字。RT-PCR检测电泳阳性结果照片，实时荧光PCR扩增曲线2 SN/录A（资料性附录）椰子败生类病毒其他信息A.1地理分布关岛。A.2寄主范围自然寄主为椰子（Cocosnucifera）。A.3为害症状在自然条件下，CTiVd侵染椰树，一般在成年结果椰子树上首先呈现症状，3a生矮种椰或5a～6a生高种椰受害状与椰子死亡病的症状相似。受侵染的植株在显症之后所产椰子的体积和形状都受到明显影响，2a～3a之后不再结实，大部分植株在10a之内死亡。椰树自然感病后首先出现树冠冠幅变小，椰果变小，畸形；随着病情发展，椰果变得更小，无内果壳，外果皮也变薄；花不孕，不再结果；拂焰苞花序坏死至不产生花序。感病初期叶面上出现针头大小的退绿斑，多呈现于小叶叶尖，随病情发展加重，退绿斑逐渐增多，最后布满叶面。椰叶逐渐脱落，冠幅越来越小，最后叶片全部掉落，椰树死亡。感病椰树树干生长受阻，不增粗，树干从基部往上，逐渐缩小，呈圆锥形。植株受害症状参见图A.1和图A.2m图A.1感病椰子果实受害症状（引自Randles，J.W.1998） SN/T4728—2016椰树及果实感病状（引自Wall，G.C.2003）图A.2A.4传播途径CTiVd能种传，但种传率很低；也可通过花粉或机械方式传播。A.5基因组特征该类病毒基因组为裸露的单链脱氧核糖核酸（ssRNA），环状或线状，低分子量，以单体和二聚体共价联结的环状或线状分子存在。已经获得椰子败生类病毒全长254个核苷酸，含有多数类病毒共有的中央保守序列，长度为44个核苷酸。基因组全序列：60ctggggaatt cccacggctc ggcaaaataa aagcacaaga gcgactgcta gagggatccc120cggggaaacc cctagcaacc gagg