SN_T 3740-2013国境口岸圣路易斯脑炎病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3740--2013国境口岸圣路易斯脑炎病毒检测方法实时荧光 RT-PCR法Detection method for St Louis encephalitis virus at frontier ports---Real-time fluorescence RT-PCR2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局量 SN/T 3740—2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：胡孔新、史蕾、杨鹏飞、燕清丽、张丽萍、徐焕洲、孙肖红、刘丽娟、杨宇、王静1 SN/T 3740-2013国境口岸圣路易斯脑炎病毒检测方法实时荧光 RT-PCR 法1范围本标准规定了国境口岸圣路易斯脑炎病毒感染疑似病例或蚊携带圣路易斯脑炎病毒的核酸实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、保存及转运、样本处理、检测方法、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸圣路易斯脑炎病毒感染疑似病例或蚊携带圣路易斯脑炎病毒的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号）3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1圣路易斯脑炎病毒‧St.Louis encephalitis virus属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属《Flduivirus）单股正链 RNA 病毒，与日本脑炎病毒、西尼罗病毒、默累谷脑炎病毒（Murray Valley Encephalitis virus）、昆津病毒（Kunjun virus）等同属一个血清型，是种虫媒病毒，主要经库蚊（在美国确定的传播媒介以蚊虫 Culertarsalis、Cr.pipiens、Cr.quinque-fasciatus 和Cr.nigripalpus 为主)传播鸟类为主要宿主，以鸟-蚊-鸟的循环作为基本传播周期。人类是目前已知的自然感染该种病毒后致病的唯一物种，该病毒感染人类后可引起发热、头痛等流感样症状，也可表现为中枢神经系统感染症状，严重者可死亡。4检测对象国境口岸圣路易斯脑炎病毒感染疑似病例或截获的蚊虫。5实验室生物安全要求5.1检测工作中的个人防护参照GB19489。5.2生物安全应遵照GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。5.3使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。1 SN/T 3740-20136仪器设备与试剂6.1仪器设备常用仪器设备如下：超净工作台;二级生物安全柜；一微型混合器、涡旋振荡器；一超低温冰箱（一70℃及以下）;-普通台式离心机；一高速冷冻离心机（离心力可达20000g）;-可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μI)及配套带滤芯吸头；荧光 PCR 检测仪（如 LightCycler、ABI Prism 7500 型、ABI Prism 7000 型等）。6.2试剂常用试剂如下：-商品化系统如 BD Universal Viral CulturetteTM Transport System;-Ag-Path-IDTM one-step RT-PCR 试剂盒。7样品采集、保存与转运7.1样本采集7.1.1人血清样本：采集疑似病例的静脉血 3ml～5 ml.,室温静置30 min使其凝固周,然后1500 rmin~2 000 r/min 离心10 min，去除纤维蛋白和红血球，收集血清于2 mI.无菌螺口塑料管中。7.1.2蚊样本：根据实际工作需要采集蚊虫样本，按1～5只或适量为一组，装人2mL螺口塑料管内。7.2样本的保存采集的人血清样本或分类分组后的蚊虫样本，装人螺口塑料血清管，用低温油性记号笔记上缩号，于一70℃以下保存待检。7.3样本转运疑似人感染圣路易斯脑炎病毒感染材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。8样本处理8.1疑似病例血清样本无需处理可直接提取核酸进行检测，如不能及时检测应存放在70℃以下的冰箱。1）油指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 3740--20138.2蚊虫样本在冰上操作。取出蚊标本，倒入