SN_T 3987-2014牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3987---2014牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法Detection of specified risk materials of bovine spongiform encephalopathy(BSE)by real-time fluorescent RT-PCR method2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、刮涂层查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR 检测方法SN/T 3987—2014*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张 0.5字数 10千字2015年12月第一版2015年12月第次印刷印数 1—1100*书号：155066·2-29320 SN/T 3987—2014前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、北京市兽药监察所、中国合格评定国家认可委员会。本标准主要起草人：史喜菊、李冰玲、郭志红、马贵平、苏志明、李炎鑫、刘全国 SN/T 3987---2014牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了牛海绵状脑病特殊风险物质实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于牛肉中牛海绵状脑病特殊风险物质的定性检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1实时荧光 PCR real time fluorescent PCR实时荧光聚合酶链式反应。3.1.2I cycle thresholdCt 值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。GFAP:胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)MGB:探针标记荧光集团（minor groove binder)SRM：牛海绵状脑病特殊风险物质(specified risk material)4主要仪器4.1实时荧光PCR仪。4.2高速台式冷冻离心机（最高离心力12000g以上）。4.3漩涡振荡器。4.4冰箱(2℃～8℃冰箱、一20℃冰箱、一80℃冰箱）。5微量移液器及各种配套带滤芯吸头（10 μl、200μL、1000 μuL）。4.51 SN/T 3987—20144.6一次性棉签和研磨用具。5主要试剂5.1总 RNA提取试剂盒。5.2 Ready-To-GoTMRT-PCR Beads5.3TaqTM PCR 试剂盒。5.4引物和探针序列：上游引物序列:5’ACC TGC GAC CTG GAG TCC T 3下游引物序列:5CTC GCG CAT CTG CCG 3探针序列:56-FAM-ACT CGT TCG TGC CGC GC-MGB 3也可以使用试剂盒中的引物、探针预混液。5.5阳性对照阳性对照为健康牛的脑或脊髓，也可以使用试剂盒中的阳性RNA对照品。5.6阴性对照阴性对照的模板是DEPC处理水。6　方法原理牛海绵状脑病99%的感染性分布在中枢神经组织，主要集中于脑和脊髓。因此，牛海绵状脑病特殊风险物质(SRM)的检测主要是检测中枢神经组织，而中枢神经组织的检测是通过检测其标记物胶原纤维酸性蛋白(GFAP)来实现的。本标准以GFAP mRNA为检测靶目标，通过实时荧光 RT-PCR技术检测牛海绵状脑病特殊风险物质。7 检测步骤7.1样品采集与制备7.1.1可供检测的样品包括鲜牛肉、冷冻牛肉及其制品。如果样品是组织勾浆，取100uL匀浆液；如果样品是固体，选择表面不同区域，用一次性消毒棉签刮取组织表面，每个样品大约25mg。7.1.2每个样品加入600μL裂解液（如果使用棉签刮取，加人裂解液后要用力挤压，将棉签内的液体充分挤出）。7.1.3加人裂解液的样品可以立即使用，4℃条件下保存不超过48h；若需长期保存应置一80℃冰箱，但应避免反复冻融。7.2核酸提取7.2.1取阳性对照100 μL，加人裂解液 600 μL，与加了裂解液的样品一起进行如下处理。7.2.215℃～30℃温育