SN_T 2605-2010油棕猝倒病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2605-2010油棕猝倒病菌检疫鉴定方法Identification of Pythium splendens Braun2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局敏码防 SN/T2605—2010言前本标推按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准参加起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：张建成、张慧丽、吴品珊。 SN/T2605—2010油棕猝倒病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中油棕猝倒病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于油棕猝倒病菌寄主苗木、插枝等植物材料及其土壤和介质的入境检疫。2原理学名：Pythium sptendensBraun1925。异名：Pythium splendens var.hawaiianum Sideris 1932。中文名：油棕猝倒病菌。别名：油棕苗疫病菌、天竺葵黑胫病菌、华丽腐露。油棕猝倒病菌属藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），卵菌纲（Oomycetes），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae），腐霉属（Pythium）。油棕猝倒病菌在世界上分布于温暖和亚热带地区（参见附录A第A.1章），其寄主范围很广，为害上百种植物（参见附录A第A.2章）。病原菌侵染植物的幼苗和根部，引起种子腐烂，幼苗萎、猝倒，插枝及成株茎部变黑、根腐。其传播途径为土壤、繁殖材料。以油棕猝倒病菌在寄主植物上的症状、形态学特征和生物学特征为鉴定依据。3仪器设备生物显微镜（具油镜镜头）、具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于50×）、高压灭菌器、分析天平、超净工作台、生物培养箱、解针、解刀、烧杯（50mL）、医用手术剪、镊子。4试剂和培养基4.1抗菌素和杀菌剂4.1.1氨苄青霍素（Ampicillin，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂）。4.1.2利福平（Rifampicin，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂）。4.1.3制菌索（Nystatin，研究用纯粉剂或市售医用内服片剂）。4.1.4：苯菌灵（Benomyl,研究用纯粉剂或市售可湿性粉剂）。4.1.5五氯硝基苯（Pentachloronitrobenzene，研究用纯粉剂或市售可湿性粉剂）。4.2试剂棉蓝试剂。4.3培养基4.3.1基础培养基用于油棕猝倒病菌的保存和培养性状的观察、测定。 SN/T 2605—2010采用10%V8培养基，番茄汁培养基，其配置方法及步骤见附录B。4.3.2选择性培养基用于油棕猝倒病菌病原菌的分离和纯化。1000mL基础培养基经常规灭菌并冷却到55℃左右时加人下列抗菌紫（均为有效成分）：氨青霉素200mg，利福平100mg，制霉菌素50mg，苯菌灵100mg，摇匀，制成平板。其中研究用纯苯菌灵粉剂和纯利福平粉剂需事先配制成酒精溶液（母液），并使培养基中的最终酒精浓度不大于0.5%。苯菌灵可用相同药量的五氯硝基苯替代。5症状检查i仔细检查根部，症状是茎变黑和萎缩，自基部开始腐烂，出现灰色或粽黑色水溃状斑点，病害扩展的最前缘通常清晰可辨。顶端的叶片特征性的称状凹陷比健康植株绿偏淡，根系严重腐烂。对可疑植物和繁殖材料的介质土应取样送实验室做进一步检验。6实验室检验6.1病原菌检查选取有萎症状的叶片，根部变竭腐烂的植株，用解剖针挑取或用解剖刀刮取病斑背面的霉状物或病组织制片，在显微镜下直接检查有无病菌的菌丝、菌丝膨大体记录其形态特征。6.2组织分离选萎熹及根部变褐但没有完全腐烂的构物材料，用流动的自来水冲洗干净，在根茎病健交界处切取0.5cm长的小块，无菌水浸洗3次，灭菌吸冰纸直吸干水分后转移到选择性培养基，于25℃~30℃黑暗培养3d。6.3土壤诱集对禾本科植物叶片（如：马唐、狗尾草、稗草等）进得高温高压灭菌处理，剪成直径】cm大小的小片作为诱饵。取5g～20g土壤样品研磨破碎放入50元mL灭菌范净烧林中，厚度不超过2cm，缓慢加入无菌水没过土表1cm～2cm用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣，每烧杯水面放置诱饵10片左右。静置过夜，将感染的诱饵取出，用无菌水洗净表面，吹干或无菌吸水纸吸干，放入选择性培养基平板上培养。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝，无隔多核的菌落，挑取菌丝尖端转移到基础培养基上25℃～30℃黑暗培养3d。6.4培养物观察得到病菌纯培养物后，挑出菌丝制片。用0.5%棉蓝乳酚液包埋，用解剖针将菌丝尽量展开，观察病菌特征。6.5PCR鉴定方法PCR鉴定方法参见附录C。P.splendens的特异性引物Pspl和ITS-2的序列