SN_T 2833-2011委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2833—2011委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范Quarantine protocol for venezuelan equine encephalitis2011-02-25发布2011-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防饮 SN/T 2833--2011言前本标准按照GB/T1.1一2009 给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织公布的《陆生动物手册》（2009年版）第2.5.14章“委内瑞拉马脑脊髓炎”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：一细化了间接免疫荧光分型试验方法；一增加了血凝试验内容;一修改了 IgM捕获ELISA 的底物作用时间为 30 min～35 min;删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、肖进文、李应国、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、朱来华、周启明。 SN/T 2833--2011委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范1 范围本标准规定了委内瑞拉马脑脊髓炎的病毒分离、间接免疫荧光分型试验、血凝抑制试验、IgM捕获ELISA 和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的委丙瑞拉马脑脊髓炎检疫。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所用的修改单)适用于本文件。GB/T18088　出入境动物检疫采样3 缩略语下列缩略语适用于本文件。VEE(venezuelan equine encephalitis)：委内瑞拉马脑脊髓炎EEE(eastern equine encephalitis):东方型马脑脊髓炎WEE(western equine encephalitis):西方型鸟脑脊髓炎RK-13 细胞系(rabbit kidney-13 cellline)：:兔肾细胞系Vero 细胞系(african green monkey kidne cell liné）:非洲缘猴肾细胞系4　生物安全要求本标准的病毒分离、间接免疫荧光分型试验和蚀斑减数中和试验，均需要在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。人员需提前进行VEE疫苗免疫,蚀斑减数中和抗体滴度在1：20以上。5样品采集5.1试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见A.1.3）、柠檬酸钠抗凝剂（配制见A.1.4）。5.2采样数量和类型采样的数量按照GB/T18088的要求执行。样品类型包括：全血、血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。1 SN/T 2833—20115.3采集方法血液样品5.3.1无菌采集10 mL～15 mL全血，立即转至含柠檬酸钠抗凝剂（终浓度为10%）的离心管中，低温运送。5.3.2血清样品每头动物采集全血 10 mL～15 mL,提取血清 3mL以上，低温运送到实验室。5.3.3脑脊液样品无菌采集脑脊液1mL以上，立即低温运送到实验室。5.3.4组织样品无菌采取动物的脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温48 h内运送到实验室。如果48 h内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。6 病原分离鉴定6.1 病毒分离6.1.1设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥3000g）、生物安全柜（ClassⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器(1.0 mL～10 mL)及配套枪头。6.1.2试剂和材料 RK-13 和(或)Vero 细胞。 MEM 培养基。3日龄～5 日龄乳鼠。 6 日龄～8 日龄 SPF鸡胚。胎牛血清(无BVDV抗体及其他牛病抗体)。样品缓冲液，配制见A.1.3。细胞生长液和维持液，配制见A.2.1。ATV缓冲液,配制见 A.2.2。6.1.3操作方法样品制备组织样品低温均质后，加人样品缓冲液制成10%悬液，1500g，4℃离心20min。取上清液过滤除菌,置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。细胞分离试验用适量 ATV缓冲液,将培养的 RK-13细胞和(或)Vero 细胞传代。待细胞长至80%～100%,每瓶细胞按10%体积加人样品悬液,37℃感作1 h～2 h后加人细胞维持液,37℃培养6d～8 d,逐日观察2 SN/T 2833—2011细胞病变。每份样品接种 RK-13 和(或)Vero 细胞各 2 瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则将细胞反复冻融3次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞;将出现70%～90%细胞病变的细胞培养物反复冻融后,取上清液进行间接免