SNT 2300-2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2300—2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法Detection of mosquito-borne chikungunya virus at frontier port2009-07-07 发布2010-01-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局屋技15查：数码防伪 SN/T: 2300—2009前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：黄吉城、郑夔、洪烨、李小波、幸芦琴、师永霞、钟玉清、相大鹏、郭波旋、胡龙飞、陈永红，本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 2300--2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法1范围本标准规定了国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法，包括标本采集、处理、检测程序、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸蚊类携带基孔雅病毒的实验室检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB19489实验室　生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标推3. 1基孔肯雅病毒chikungunya virus基孔肯雅病毒是单股RNA病霉.属于披膜病毒科甲病毒属、毒颗粒呈球形，平均直径42nm，相天对分子质量为4.3×108,沉降系数为46.$。该病毒感染人可引起基礼肯雅热，主要临床表现为发热、关d，伊蚊是其主要传播媒介。节疼痛、皮疹和轻度出血等。本病潜伏期33.2实时荧光 RT-PCR real-time fluorescente RT-PCR实时荧光 RT-PCR方法是在常规RT-PCR 的基础上-条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灾荧光基幽。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，利用ag酶的5，-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数，用Ct 值（cycle threshold)表示4实验室生物安全要求4.1基孔肯雅病毒培养和动物感染实验应在生物安全三级(BSI-3)实验室内进行。4.2未经培养的基孔肯雅病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行。4.3基孔肯雅病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行。4.4基孔肯雅病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。4.5其他要求按GB19489进行。5主要仪器设备主要仪器设备如下：荧光定量PCR仪； SN/T 2300—2009二级生物安全柜；-CO2 培养箱；-倒置显微镜;高压灭菌器;70℃超低温冰箱（或液氮罐）；冷冻离心机（带密封的离心安全杯，最大离心力20000g）；玻璃研磨器；一涡旋器。6·主要试剂6.1标本处理液：在新鲜配制的95mLMEM（最低必须培养基，配方见附录A）中加人56℃热灭活30 min的胎牛血清 2 mL、l mL庆大霉素(5000 μg/mL）、l mL两性霉素 B(250 μg/mL)和1 mI.青链霉素（青霉素G10000U/mL、链霉素10000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2。6.2Hanks液:配方见附录 A。6.3核酸提取试剂：用QIAampViral RNAKit，详见试剂盒说明书1），内含AVL、AW1、AW2和AVE等成分。6.4 Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit,美国 Ambion 公司产品1)。6.5 DEPC水。6.6实时荧光RT-PCR检测的引物和探针：CHIK-FP5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3CHIK-RP 5′-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3′CHIK-probe5’FAM-TGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’（LNA 探针，下划线斜黑体字母表示LNA 修饰碱基）。7 标本的采集与处理7.1根据监测任务等实际工作需要采集所需数量的蚊子标本（参见附录B）。7.2将采集的蚊子直接放人一20℃冰箱30min以上冻死后，取出，分类编号，按30只一份，装人2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号，立即放人液氮罐或干冰内（一70℃以下)运输或保存。7.3标本的处理：在冰上操作。从一70℃以下超低温冰箱中取出蚊标本,倒人研磨器