SN_T 4650-2016瓜炭疽病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4650—2016瓜炭疽病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Colletotrichum orbiculare (Berk.Et Mont.) Arx2016-08-23发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真 SN/T 4650—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫局、石河子大学、新疆农业科学研究院。本标准主要起草人：王独、张小菊、黄丽莉、孙燕飞、张祥林、张伟、李亚伟、张瑜、韩盛、杨度I SN/T4650—2016瓜炭疽病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了瓜类炭疽病菌Colletotrichumorbiculare（Berk.Et.Mont.）Arx的检疫鉴定方法。本标准适用于进出口瓜类植物种子、植株、果实中瓜类炭疽病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1809进出境植物种子检疫规程3瓜炭疽病菌基本信息学名：Colletotrichumorbiculare（(Berk.EtMont.)Arx异名：Colletotrichumlagenarium(Pass.)Ell.etHalst.无性世代学名：Colletotrichumorbiculare(Berk.EtMont.)Arx有性世代学名：Glomerellalagenaria（Pass.）WatanableetTamura分类地位：瓜炭疽病菌属子囊菌门（Ascomycota）、盘菌目（Pezizales）、盘菌科（Pezizaceae）、围小丛壳属（Glomerella），无性态属黑盘孢目（Melanconiales）、黑盘孢科（Melanconiaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum)4方法原理瓜炭疽病菌的症状表现、培养性状、形态学特征、致病性及PCR特异性扩增检测结果作为瓜炭疽病菌的检疫鉴定依据。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备生物显微镜、体视显蔽镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。1%次氯酸钠，DNA提取相关试剂（盒），PCR相关试剂，电泳试剂。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（配制方法见附录A）。1 SN/T4650—20166检验方法6.1取样和制样按照SN/T1809的方法抽取进出境瓜类种子样品。挑选皱缩、干癌、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒。植株组织主要检查茎蔓、叶柄部和果实。选取叶片上呈圆形、纺锤形的黑色病斑，外围环绕晕圈，果实圆形或椭圆形病斑，有凹陷龟裂处（参见附录B和附录C)，进行分离。6.2分离培养可将挑选出的可疑瓜类种子置于25℃保湿24h，再经一20℃下24h冷冻处理后用做培养。叶片、茎杆和果实样品可用无菌刀片切取病健交界处3mm～5mm左右的组织进行培养。病斑表面散生有黑色小粒点（病菌的分生孢子盘）的，可以直接用挑针挑取移至培养基上培养。无菌条件下将供试材料用3%次氯酸钠表面消毒5min～10min，无菌水洗3次。将处理好的材料置于含青/链霉素微酸性的PDA培养基平板上，每血放置3粒4粒种子或5块～6块组织，于25℃下12h光照黑暗交替培养。培养第3天后开始观察，若发现乳白色或白色可疑菌落，立即用PDA培养基进行纯化。在无菌条件下挑取菌丝制片，于显微镜下观察菌丝和分生孢子形态。如无分生孢子产生，可在25℃的恒温箱中黑暗条件培养5d～7d，4d紫外灯照射（间隔12h），再2d暗处理后进行观察，并制片镜检。6.3PCR检测将分离出的可疑菌落，接种到PDA培养基上，25℃培养5d，挑取菌丝，用CTAB法或商业化试剂盒提取疑似分离物DNA，进行PCR检测（参见附录D)。PCR扩增产物检测中，阳性样品应出现294bp和159bp两条泳带。6.4致病性测定实验室首次检出该病菌需做致病性测定。将形态特征与瓜炭疽病菌相符或PCR检测阳性的分离物进行致病性测定。用灭菌土播种健康瓜类种子，待长出3片～5片真叶后，用灭菌牙签或刀片在茎秆处穿刺或切开组织，用无菌打孔器在培养基上取瓜炭疽病菌菌丝块，接种在伤口上，将湿润的脱脂棉包裹伤口，用塑料袋覆盖，28℃左右，相对湿度100%，黑暗条件下保湿48h，接种后5d～10d后观察接种点附近是否出现可疑病斑，观察症状并对