NY_T 2839-2015致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2839—2015致仔猪黄大肠杆菌分离鉴定技术Isolation and Identification of Escherichia coli Causing PigletsYellow Dysentery2015-10-09发布2015-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2839—-2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出，本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。本标准主要起草人：陈义平、郭玉广、南文龙、高崧、成大荣、杜元钊、高清清、马爽、程增青。1 NY/T 2839—2015引言仔猪黄是由致病性大肠杆菌引起的以初生仔猪下痫为特征的传染病。该病主要引起7日龄以内的仔猪发病，特征是排出黄色水样粪便以及渐进性死亡，病死率达30%以上，甚至全窝死亡，是影响仔猪成活率的主要疾病之一。根据仔猪的发病日龄和临床症状可以初步做出诊断，但是确诊则需要对致病菌株进行分离鉴定。因此，进行致仔猪黄痫大肠杆菌的分离鉴定，对仔猪黄痢的防治具有重要意义。本标准制定了致仔猪黄大肠杆菌的病料采集、病原菌分离及鉴定方法Ⅱ NY/T 2839--2015致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定技术1范围本标准规定了致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定的操作程序和判定标准。本标准适用于致仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.38—2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫SN/T0169—2010进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法中华人民共和国农业部公告［2003]第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本文件：V-P:乙酰甲基甲醇试验Voges-Proskauer reactionPCR：聚合酶链式反应Polymerase chain reactionPBS：磷酸盐缓冲液PhosphatebuffersalineSPF：无特定病原微生物Specefic pathogen freeDMEM:培养基 Dulbeccos Modification of Eagles MediumPEG:聚乙二醇 PolyethyleneglycolHAT：含黄嘌呤(hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）的DMEMHT：含黄嘌呤（hypoxantin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）的DMEMdNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸deoxyribonucleosidetriphosphatesbp：碱基对basepairTBE:Tris-硼酸电泳缓冲液r/min：转/分钟rotations perminutemin:分钟minuteh:小时hour4试剂4.1麦康凯、大豆陈琼脂、Minca、Slanetz等培养基：制备参见附录A。4.2葡萄糖发酵、吲哚、甲基红、V-P、枸橡酸盐利用等生化试验管：制备参见附录B。4.3兔抗K88、K99、987P、F41菌毛阳性血清及阴性对照兔血清：制备参见附录C。4.4K88、K99、987P、F41菌毛特异性单克隆抗体及阴性对照鼠血清：制备参见附录D5器材超净工作台、恒温培养箱、酒精灯、接种环、手术刀、玻璃板或载玻片、微量移液器（10μL、20μL、1 NY/T 2839—2015200 μL、1 000 μL)。6病料样品的处理6.1病料样品采集：仔猪黄痫多发于7日龄以内仔猪，发病仔猪不愿吃奶，拉黄痢，多呈黄色水样，内含凝乳小片，后肢常被粪液。发病严重的仔猪很快消瘦，最后衰竭死亡。胃肠呈卡他性炎症，病变主要表现为胃黏膜红肿，肠黏膜肿胀、充血或出血，肠系膜淋巴结肿大。采集疑似病例的肛拭子或肠道（十二指肠、空肠、回肠）作为细菌分离用病料。6.2病料样品的存放与运送：病料样品置2℃～8℃条件下保存，并在3d内进行细菌分离。如果超过3d，应置含10%甘油的0.01mol/LpH7.4PBS中，一15℃以下暂时保存，并尽快进行细菌分离。运输时确保低温运送，并及时送达，以防样品腐败。按照中华人民共和国农业部公告【2003］第302号的规定进行样品的生物安全标识。7致仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定方法7.1细菌分离与纯化：将肠道病料置超净工作台中