NY_T 3436-2019柑橘属品种鉴定 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.01B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3436—2019SSR分子标记法柑橘属品种鉴定Identification of Citrus varieties--SSR marker method2019-09-01实施2019-01-17 发布“中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3436—2019目次1前言范围·2规范性引用文件术语和定义3主要仪器设备及试剂.4溶液配制56引物相关信息及使用·参照品种及使用8操作程序9结果统计10结果判定.附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂.附录B(规范性附录)溶液配制·附录C(规范性附录)核心引物名单及序列lo核心引物相关信息附录D(规范性附录)参照品种名单附录E(资料性附录)16T NY/T 3436—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部种业管理司提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口。本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、湖南农业大学、西南大学。本标准主要起草人：唐浩、李益、韩瑞玺、江东、邓超、马莹雪、李娜、邓子牛、赵艳杰。I NY/T 3436—2019柑橘属品种鉴定SSR分子标记法1 范围本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）标记进行芸香科（Rutaceae)柑橘属（CitrusL.）品种鉴定的操作程序、结果统计、结果规则。本标准适用于柑橘属品种SSR指纹数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2435植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南柑橘NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则3术语和定义NY/T2594界定的术语和定义适用于本文件。4主要仪器设备及试剂主要仪器设备及试剂见附录A。5溶液配制溶液配制方法见附录B。6引物相关信息及使用核心引物名单及序列见附录C，核心引物相关信息见附录D。根据需要，标准研制单位及时筛选拓展引物并发布相关信息用于鉴定，和品种权人提出特异引物用于鉴定。检测机构首先使用核心引物，其次根据需要使用拓展引物或（和）特异引物进行鉴定。7参照品种及使用参照品种的名称参见附录E。必要时，可在等位变异检测中同时检测相应参照品种的PCR扩增产物。注：多个品种在某一SSR位点上可能具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录D中的参照品种使用。8操作程序8.1样品准备每份样品取不少于3个单株的叶片或其他等效物，混合分析。8.2DNA提取将混合后的样品放人液氮预冷的研钵中，加人液氮后迅速研磨叶片多次至粉末状，取适量粉末装入2mL离心管。每管加人1mL预热（65℃）的2%CTAB提取液，充分混匀，65℃恒温水浴45min～60 NY/T 3436—2019min，其间每隔10min颠倒混匀。于4℃，12000r/min离心15min。取上清液至一新离心管，加人等体积的氯仿-异戊醇（24：1,V：V），轻轻颠倒混匀，静置10min，于4℃，12000r/min离心15min。取上清液至一新离心管，加人等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一20℃下静置30min。于4℃，12000r/min离心10min，弃上清液。70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干，加人50uL超纯水，加1uLRNase（10g/L），37℃温浴30min；再加人等体积的氯仿-异戊醇（24：1,V：V），于4℃，12000r/min离心15min;取上清液，加人等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一20℃下静置30min；12000r/min常温离心15min，弃上清液。用70%乙醇浸泡洗涤DNA沉淀2次，风干，加人100μL无菌水或TE缓冲液，通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，一20℃保存。注：以上为推荐的DNA提取方法，所获DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法都适用于本标准。8.3PCR扩增8.3.1反应体系各组分终浓度如下：每种dNTP0.20mmol/L，正向、反向引物各0.25μmol/L，TaqDNA聚合酶0.05U/μL，1XPCR缓冲液（含Mg2+2.5mmol/L),DNA溶液2.5ng/μL,其余以超纯水补足至所需体积。利用毛细管电泳进行荧光检测时需使用荧光标记的引物。引物标记的荧光颜色见附录D。注：反应体系的体积可根据具体情况进行调整。可采用2×TaqPCRmast