SN_T 2665-2010香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2665-2010香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法Identification of Fusarium oxysporum f. sp. cubense2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布KD国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2665—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标主要起草人：陈定虎、杨雷亮、罗利娟、王章根、邱德义、王云华、管维。 SN/T 2665—2010香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法‧范围1本标准规定了对进出境香蕉种苗、组培苗及其他香蕉种质资源、商品用香蕉等中香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.cubense)的检疫和鉴定方法。本标准适用于所有进出境香蕉种苗、组培苗及其他香蕉种质资源、商品用香蕉等中的香蕉枯萎病菌的检疫。2规范性引用文件凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。‘第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T 1538.1培养基制备指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3. 1PDA 培养基 PDA medium马铃薯葡萄糖琼脂培养基，用于分离植物病原真菌。3.2YPD liquid mediumYPD培养液酵母蛋白陈葡萄糖培养液,用于培养香蕉枯萎病菌产生分生孢子。3.3厚垣孢子chlamydospore由菌丝个别细胞膨大形成,具有厚壁和浓缩的原生质,可抵抗高温、低温、干旱、营养短缺等不良环境条件的一种休眠孢子。4原理香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病,是破坏维管束导致植株死亡的毁灭性病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型，其英文名为 Banana Fusarium Wilt,Banana banama disease，学名为 Fusariumorysporum f.sp.Cubense。属于半知菌亚门（Deuteromycotina)，丝孢纲（Hyphomycetes），瘤座孢目(Tuberculariales).该病原菌的危害症状、菌落的形态特征、致病性测定结果和寄主范围是鉴定该病菌的依据。5仪器设备和试剂5.1仪器设备电子天平（感量 1/10 000 g）、超净工作台、高压灭菌锅、低温冰箱、纯水器、可调微量加样器(2 μL～ SN/T 2665—2010200uL）、培养箱、光学显微镜、照相机、铲、枝剪、砍刀、纸袋、油性笔、小刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、挑针、酒精灯等。5.2试剂和材料无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、琼脂、酵母浸出粉、蛋白陈、葡萄糖、0.1%升汞、灭菌水、40%甘油、巴西蕉、广东香蕉2号等。培养基配制按 SN/T 1538.1.规定。6现场检查取样时应进行针对性检查,注意检查有无可疑病株。若有可疑病株应将其挑出来,并送实验室作进一步检验鉴定。在以上针对性检查基础上，再按照相关标准规定进行取样。7实验室检验7. 1 症状检查受侵染的植株的症状参见附录A。7.2保湿培养取待检样品的组织切成1cm长的小段，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，在75%的酒精溶液中浸泡1min,经灭菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为1mm～4 mm 的小片,放置在垫有 3层灭菌湿滤纸的培养皿中,每血5片～10片,转至25℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照各12h交替，观察植物残体表面是否出现白色菌丝或霉状物。7.3病菌的分离培养从病株病健交界处切取小块组织，采取常规组织分离法进行分离：将香蕉球茎组织切成 1 cm～1.5cm的方块，先放人70%乙醇溶液中10 s，再转人0.1%升汞溶液中浸泡1min～2min进行表面消毒处理，然后用灭菌水漂洗3次，于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片除去外皮后再细切成0.3.cm～0.5cm的小方块，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，25℃下培养；小苗则是将球茎切成约0.3cm的小方块，先放于 70%乙醇溶液中浸5 s,再转人 0.1%升汞溶液中浸泡15 s～60 s进行表面消毒处理,灭菌水漂洗3次后于无菌滤纸上晾干，置于 PDA平板上，25℃下于 PDA 培养基上培养,待长出菌落后再对其形态进行显微观察，挑取菌落边缘菌丝进行单孢分离。7.4病原菌致病性测定采用病原菌孢子悬浮液接种香蕉组培苗来确定病原菌致病性。将分离、纯化得到的病原菌菌株在25℃酵母蛋白陈葡萄糖培养液(YPD 培养液参见附录 B)中、黑暗条件下振荡培养2d～3d，即可产生大量的小型分生孢子。离心去除培养液并用无菌水冲洗，然后配制成浓度约为1×10个孢子/mL的孢子悬浮液。