NY_T 2476-2013大白菜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 67.080.20B 31NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2476—2013大白菜品种鉴定技术规程SSR分子标记法Identification of heading Chinese cabbage varieties--SSR marker method2013-12-13 发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部-5发布 NY/T 2476:-2013目次前盲范围·12规范性引用文件3术语和定义原理.45仪器设备及试剂…6溶液配制引物…78参照品种及其使用·9操作程序10等位变异数据采集11判定标准附录A（规范性附录）仪器设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配制·附录C（规范性附录）核心引物附录D(资料性附录)参照品种名单， NY/T 2476—2013前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的贵任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归I1。本标准起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：李汝玉、张晗、王东建、张新明、郑永胜、孙加梅、宋国安、姚风霞、许金芳、段丽丽、李华、王雪梅。II NY/T 24/6-—2013大白菜品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列(Simple scquence repeats,SSR)标记进行大白菜LBrassica rapaL.ssp.Pekinensis(Lour.）Olsson]品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于大自菜SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对·于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物 core primer多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3.2reference variety参照品种对应FSSR位点上不同等位变异的一组品种。参照品种用于辅助确定待测样品等位变异的大小，校正仪器设备的系统误差。4原理SSR广泛分布于大白菜基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列一般是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中，主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大白菜品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。7引物引物相关信息见附录C。8参照品种及其使用参照品种的名称见附录C，参照品种名单参见附录D。 NY/T 2476-—2013在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。注1：多个品种在某·SSR位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录C中的参照品种使用。注2：间·名称不同来源的参照品种的某：-位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用。注3：对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应参照品种。9操作程序9.1重复设置设置2次生物学重复。9.2样品准备种子样品的钎样、分样和保存，应符合（GB/T3543.2的规定。每个品种分取2个样品，每个样品30个个体（种、叶片或其他器官组织），等量混合。9.3DNA提取采用CTAB法：取幼嫩组织混合样0.2g，放人1.5mL离心管中，在液氮中研碎；或将种·于研碎，放人1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加人400μL，混匀样品。将离心管置65℃金属浴或水浴锅中，保溢30min后取下。向离心管中加人400μl.24：1氯仿一异戊醇（V：V），振荡混勺。10000g离心10min。将上清液200μl转人另·只1.5ml离心管，加人400μl，-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，奔.l清液，加人500ul乙醇：·乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀。加人100μLTE(pH8.0)溶液溶解IDNA，检测I)NA浓度。-20℃保存。注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的IDNA提取方法都适用于本标准。9.4PCR扩增9.4.1反应体系25μl的反应体积，含每种dNTP0.25mmol/I.，正向