NYT 1433-2007水稻品种鉴定 DNA指纹方法.pdf

ICS 65.020.01B 61NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1433—2007DNA指纹方法水稻品种鉴定Identification of Rice (Oryza sativa L.) Varieties Using Microsatellite Markers2007-12-01实施2007-09-14 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1433—2007前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B、C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国水稻研究所、农业部科技发展中心、农业部稻米及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：庄杰云、施勇烽、吕波、陈能、杨坤、应杰政、曾瑞珍。! NY/T 1433—2007水稻品种鉴定DNA指纹方法1范围本标准规定了水稻(Oryza sativa L.)品种DNA指纹鉴定的实验方法及判定标准。本标准适用于水稻品种差异性鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB 4404.1　粮食作物种子　禾谷类GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理通过化学方法使水稻DNA从样品的不同成分中分离出来，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其他次生代谢物,以及样品中加人的三氯甲烷、异戊醇、乙醇等试剂,获得纯化的 DNA,作为 PCR反应的模板。对模板进行 PCR扩增,得到的 PCR 产物在电泳过程中的电荷效应作用下得到良好的分离,通过显色显示水稻DNA谱带类型。不同品种由于遗传组成不同，引物 DNA序列存在差异或引物结合部位之间的 DNA片段大小存在差异,这种差异可利用电泳图谱加以鉴别,从而对品种差异性进行鉴定。4 试剂与材料除非另有说明,本标准所用试剂均为分析纯,所用水符合 GB/T 6682中规定的三级以上水的要求。相关溶液配制方法见附录A1。4.1 甲醛。4.2 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)。4.3DNA分子量标记。4.4 石蜡油。4.5Taq DNA 聚合酶(2 Unit/μL)。4.6无水乙醇。4.710mol/L氢氧化钠溶液。4.8 10%TWEEN-20 溶液(V/V)。4.9 0.5mol/L EDTA溶液。4.10 1 mol/L Tris-HCI 溶液。4.115mol/L氯化钠溶液。4.12 DNA 提取液。4.13三氯甲烷萃取液。4.141×TE缓冲液。4.15 2.5 mmol/L dNTP 溶液。1 NY/T 1433--20074.161 mol/L硫酸氨溶液。4.175×PCR反应缓冲液。4.1825mmol/L氯化镁溶液。4.19引物溶液,推荐使用的引物及其序列参见附录 C。4.20 70%乙醇溶液(V/V)。4.21 5×TBE缓冲液。4.221×TBE缓冲液。4.23100g/L过硫酸铵溶液。4.24400g/L丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合液。4.25 10g/L琼脂糖溶液。4.26氢氧化钠显色溶液。4.270.5g/L硝酸银溶液。4.286×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂。5 仪器见附录 A2。6 分析步骤6.1试验样品试验样品为水稻种子,其质量应符合国家标准GB 4404.1中对水稻种子纯度的要求。同时检测待鉴定品种和对照品种,每个品种分别检测5个个体,对一致性差的品种可增加检测的个体数，同一批品种的各个体按下述步骤同步进行。6.2 DNA 提取从幼苗或植株上取水稻叶片 2cm～3cm放人研钵中,加入 DNA提取液 400 μL,研碎,再加人 DNA提取液 400μL;移取 500μL混合液至 1.5mL微量离心管,加人 500uL三氯甲烷萃取液,轻缓颠倒混勾。经12 000r/min离心30s至分相,取上清液400μL,转人新的1.5mL管中。加人800μL冰乙醇,轻缓颠倒混匀,经12000r/min离心3min至分相,弃上清液。再用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后,加人 50μuL1× TE缓冲液溶解沉淀,置于－20℃保存备用。6.3 PCR 扩增6.3.1 引物推荐使用的24对基本核心引物及其序列参见附录C。优先使用其中的 12对引物（推荐类型为I）,完成后若未获得确定结果,再增加其他12对引物(推荐类型为Ⅱ），如果必要可增加指定的辅助引物。6.3.2标准PCR反应液的配制及扩增准备在200μL 的PCR反应管中依次加人2μL5×PCR 反应缓冲液、0.8μLdNTP溶液和0.6μL氯化镁溶液,正、反向引物溶液各1μL、经6.2提取备用的模板 DNA1