SN_T 2774-2011国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2774—2011国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法Detection method for Yersinia pestis by protein suspension array at frontier port2011-07-01实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局作 SN/T 2774—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：王静、孙肖红、杨宇、杨永莉、胡孔新、文海燕。 SN/T 2774—2011国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法1 范围本标准规定了国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片检测方法，包括样品处理、检测方法、结果判定及报告本标准适用于国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的实验室检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部，2006年)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鼠疫耶尔森菌 Yersinia pestis鼠疫菌为耶尔森菌属由假结核菌进化而来的新生病原体，革兰氏染色阴性、不运动、不形成芽孢的球杆菌,能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一3.2Yersinia pestis F1 antigen鼠疫耶尔森菌 F1 抗原F1抗原是鼠疫菌的荚膜抗原,是鼠疫菌于 37℃条件下在细胞壁外形成的一层厚凝胶状荚膜,是鼠疫菌主要的保护性抗原。人或动物感染鼠疫菌后,F1 抗原在体内高度表达，具有明显抗吞噬和活化补体的作用。鼠疫菌F1抗原具有抗原性强、特异性高等特点，检测F1抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要依据，也是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一3.3蛋白悬浮芯片protein suspension array利用带编码的包覆荧光发色剂的微球为载体标定目标抗原或抗体，以报告分子（如：荧光染料)标记目标抗原或抗体，流式细胞仪作为检测平台，可以对抗原或抗体等生物分子进行大规模检测的一种生物芯片技术。4仪器设备悬浮芯片系统!）、微孔滤板抽滤器、真空气泵、恒温振荡器、生物安全柜、离心机、荧光显微镜、超声波清洗器、恒温培养箱、纯水机、漩涡混合仪、血球计数板。1）Luminex100/200或等效设备。 SN/T 2774—20115主要试剂与耗材5.1 试剂生物素标记试剂盒：Biotin Labeling Kit-SH(Pierce）²)或等效试剂盒，微球交联试剂盒：Amine Cou-plingKit(Bio-Rad)3)或等效试剂盒，悬浮芯片仪校准试剂盒：Bio-Plex Calibration Kit(Bio-Rad)4)或等效试剂盒，悬浮芯片仪校验试剂盒：Bio-PlexValidation Kit(Bio-Rad)5)或等效试剂盒‘，免抗鼠疫菌F1抗原抗体（或等效抗体），鼠疫F1抗原单抗2F6（或等效抗体），藻红蛋白标记链霉亲和素（SA-PE)，1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），牛血清白蛋白（BSA），N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS),鸡 IgG,兔抗鸡 IgG,羊抗兔 IgG,吐温-20。其他所需缓冲溶液配制及要求参见附录A。5.2耗材羧基化编码微球、96孔滤板、消毒液：10%的次氯酸钠溶液（含有效氯10%）、悬浮芯片仪样品流路鞘液。6抗体包被编码微球和生物素标记抗体6.1活化编码微球6.1.1取100μL编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心4min，小心吸出上清液并弃去。6.1.2加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮,振荡30s，超声 30s,14000g离心4min，小心吸出上清液并弃去。6.1.3加入100μL的微球活化缓冲液，然后先加人10μL新鲜配制的EDC工作液，再加人10μL新鲜配制的Sulfo-NHS工作液，高速振荡30s后用铝箔包裹，在室温18℃～25℃振摇20min。6.1.4加人150μL的 PBS(pH7.4)，振荡10s后，14000 g离心4min，小心吸出上清液并弃去。6.1.5重复 6.1.4 步骤一次。6.1.6加人 100 μL的 PBS(pH7.4)悬浮编码微球,中速振荡 30 s后,超声15 s。6.2抗体包被编码微球6.2.1取溶于0.03mol/LPB缓冲液（pH7.2)免抗F