NY 539-2002副结核病诊断技术.pdf

ICS_11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 539—2002副结核病诊断技术Diagnostic techniques for paratuberculosis2002-08-27 发布2002-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 539—2002前副结核病(paratuberculosis,Johnes disease)是由副结核分枝杆菌(mycobacteria paratuberculosis)引起的以反负动物为主的一种慢性、消耗性传染病,其临床症状以持续性腹泻和慢性消瘦为特征。该病广泛地分布于世界各国，引起较大的经济损失。世界动物卫生组织[World Organization for AnimalHealth（英）,Office Intentional des Epizootic（法）,OIE}将其划为B类传染病，我国也将其划为I类传染病。副结核病潜伏期长,有的终生感染而不表现出临床症状。至目前为止，尚无治疗该病的有效方法,防治该病的主要方法是监测、隔离和淘汰病畜。目前该病的检疫方法有细菌学检查和免疫学检查。后者主要是包括皮内变态反应、琼脂扩散试验、间接红细胞凝集试验、淋巴细胞转化试验、补体结合反应和酶联免疫吸附试验(EILISA）。本标准提出的补体结合反应、皮内变态反应和ELISA方法与QOIE推荐的可选择方法基本一致。本标准的附录 A为规范性附录,附录B为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省兽医研究所。本标准起草人：何昭阳、吴玉环、癫万钧、钱爱东。 NY/T 539—2002副结核病诊断技术1 范围本标准规定了副结核病的诊断技术。本标准的细菌学检查、皮内变态反应、补体结合反应适用于牛、羊、鹿等动物的副结核病诊断；ELISA 检疫方法适用于牛的副结核病诊断。2细菌学检查2.1材料准备0.5%氢氧化钠液、水浴糟、离心机等。抗酸染色法试剂：配制及染色方法见附录A。2.2操作方法取待检粪样（尽可能取带有粘液或血丝的粪便)15g～20g，加约3倍量的0.5%氢氧化钠液，混勾，55℃水浴乳化30min，以4层沙布过滤，取滤液1000r/min离心5min，去沉渣后，再以3000r/min4000r/min离心30min，去上清，用沉淀涂片。也可以直肠刮取物、病变肠段粘膜直接涂片。火焰固定，抗酸染色（见附录A)后镜检。2.3结果判定发现在细胞内有被染成红色、成丛排列的短杆菌即为细菌检查阳性（十）,否则判为细菌检查阴性(-)。3皮内变态反应试验3.1材料准备3.1.1器材游标卡尺、灭菌的1mL注射器及针头、75%酒精棉、记录本等。3.1.2变应原副结核分枝杆菌提纯蛋白衍生物(副结核PPD)或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物（禽结核PPD)。3.2操作方法3.2.1将被检动物编号,在颈侧中三分之一处中部的健康皮肤处剪毛，直径约10 cm，将注射部位的皮肤用手捏起，以卡尺测量皮肤皱褶厚度并记录。局部消毒。3.2.2将变应原以灭菌生理盐水稀释至0.5mg/mL，与皮肤呈15°～20°的角度进行皮内注射。注射后注射部位应呈现绿豆至黄豆大小的小包。无论动物种类及大小一律皮内注射0.1mL。如注至皮下或溢出，应于离原注射点8cm以远处补注一针，并在记录中加以说明。3.2.3羊在尾根无毛的皱褶部进行皮内注射。3.3结果判定注射 72 h观察反应,检查注射部位有无热、肿、痛等炎性反应,并以卡尺测量注射部位的皮肤皱褶厚度。3.3.1判定标准如下：a）变态反应阳性（十）:局部有炎性反应，皮厚差≥4 mm。 NY /T 539--2002b）变态反应疑似±:局部炎性反应不明显，皮厚差2.1mm～3.9mm。c）变态反应阴性（一）:局部无反应或炎性反应不明显，皮厚差≤2.0 mm。3.3.2羊有反应者(不论皮厚差大小和炎性反应轻重)判为变态反应阳性(十）,无任何反应者判为变态反应阴性（一）。3.3.3变态反应疑似，应于3个月后复检，于注射部位对侧的相应部位进行皮内注射，72 h后仍判为变态反应疑似,则判为变态反应阳性。4补体结合反应试验4.1材料准备4.1.1.器材12mm×37mm小试管、试管架、刻度吸管等。4.1.2试剂3%绵羊红细胞悬液：采集绵羊红细胞放于阿氏液中，4℃保存。使用时，以生理盐水洗涤3次，最后一次要求2500r/min离心15min，弃上清得红细胞泥，以生理盐水配制成体积分数为3%的绵羊红细胞悬液。溶血素、补体、禽分枝杆菌提取的脂多糖抗原、标准阳性血清、标准阴性血清等。4.2操作方法4.2:1预备试验4.2.1.1溶血素效价测定取溶血素0.2mL（商品溶血素加有等量的甘油）,加人9.8mL生理盐水，即为1：100稀释,再