SN_T 1151.5-2014对虾杆状病毒病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1151.5-2014代替SN/T1151.5—2003对虾杆状病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for tetrahedral baculovirosis2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局w.onth315.5on刮涂语查真体 SN/T 1151.5—2014-前言SN/T1151分为6部分：虾桃拉综合征检疫技术规范；对虾白斑病检疫技术规范；一斑节对虾杆状病毒（MBV)诊断方法；虾黄头病检疫技术规范；一对虾杆状病毒病检疫技术规范；对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程，本部分为SN/T1151的第5部分本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1151.5—2003《对虾杆状病毒（BP)检测方法》。本部分与SN/T1151.5一2003相比，主要技术变化如下：增加了采样；一对PCR试验引物进行了修改；增加了扩增产物的参考序列。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：史秀杰、何俊强、蒋玉婷、王津津、于力、郑晓聪、贾鹏、兰文升、杨锦舜、刘。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1151.5—2003。I SN/T 1151.5—2014对虾杆状病毒病检疫技术规范1范围SN/T1151的本标准规定了对虾杆状病毒的显微镜检查、聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3试剂和材料3.1水：符合GB/T6682一级水的规格。3.2TagDNA聚合酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3dNTPs:含dCTP、dGTP、dATPdTTP各10mmol/L3.4引物：一对引物，浓度为40μmol/I，序列为：6581F:5-TGT-AGC-AGC-AGA-GAA-GAG-36582R:5°-CAC-TAA-GCC-TAT-CTC-CAG-3扩增病毒基因中的645bp的DNA片断。5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。3.5仪器和设备44.1剪刀和镊子。4.2载玻片和盖玻片。4.3恒温培养箱。4.4普通冰箱和超低温冰箱。4.5正置显微镜。4.6离心机和离心管。4.7微量移液器及吸头。4.81PCR扩增仪。4.9电泳仪。4.10紫外观察灯或凝胶成像仪。1 SN/T 1151.5—20145采样虾卵、幼虾、仔虾取整个作为样品，稚虾、成虾（鲜活的、濒死的或有损伤的)取肝胰腺、肠或粪便作为样品。根据GB/T18088规定的数量取样。用于分子生物学检测的样品可以是新鲜的、冰冻的、90%乙醇保存的，或其他适用于DNA扩增的保存样品。6对虾杆状病毒的诊断6.1实验室环境病原鉴定的实验室环境条件应符合GB19489的要求。6.2直接光学显微镜检查6.2.1新鲜组织湿片法取活的（鲜活的、濒死的或有损伤的）对虾肝胰腺和中肠，置于载玻片上，小心地制备压片，用相差或亮视野显微镜检查包涵体。6.2.2粪便检查法该方法适用于稚虾或大一些的对虾，尤其适用于用非致死方法检查有经济价值的亲虾是否带有BP。把对虾放在水簇箱、产卵箱或其他合适的水箱中，待数小时直到水箱底部出现粪便。用塑料虹吸管吸取排泄物，放在玻璃离心管中。把粪便制成湿片，用相差或亮视野显微镜检查包涵体。6.2.3结果判定在肝胰腺、中肠或粪便的湿压片中，如果观察到上皮细胞的核内有单个或多个四面体的包涵体，可确认为对虾杆状病毒（Baculoviruspenaei,BP）感染。6.3聚合酶链式反应(PCR)检测6.3.1提取DNA将粪便、肝胰腺、中肠或待检样本匀浆后，加人10倍体积的蛋白酶K消化液（见A.1），混合振荡使样品在缓冲液中分散。60℃加热1h，然后95℃处理10min。12000r/min离心2min，将上清转移到新的离心管中，然后置于冰上备用。吸取200μL消化后的样品，加人600μL样品稀释液（见A.2），加600μL酚/三氯甲烷/异戊醇（见A.4），充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相（约700μL）：加650μL三氯甲烷/异戊醇（见A.3），用力混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）；加1.5倍体