SN_T 2754.13-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第13部分：创伤弧菌.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2754.13—2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第13部分：创伤弧菌Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogensin export food-Part 13 : Vibrio vulnificus2011-07-01实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局3B SN/T 2754.13—2011前 言SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为15个部分：第1部分：金黄色葡萄球菌；第2部分：大肠杆菌0157；第3部分：志贺氏菌；第4部分：单核细胞增生李斯特菌；第5部分：副溶血性弧菌；-第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；第7部分:空肠弯曲菌;第8部分：肺炎克雷伯氏菌；一第9部分：溶血性链球菌；第10部分：产气英膜梭菌；第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；第12部分：溶藻弧菌；第13部分：创伤弧菌；第14部分：假结核耶尔森氏菌；第15部分：阪崎肠杆菌。本部分为SN/T2754的第13部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：曾静、魏海燕、田青玫、郑文杰、易敏英、冯家望、李志勇、曾宪东、王志强、曹以诚、高东微。 SN/T 2754.132011出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法第13部分：创伤弧菌1范围SN/T2754的本部分规定了检测出口食品中创伤弧菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP)法。本部分适用于出口食品中创伤弧菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测NMKL No.156食品中致病性弧菌的检测和计数3生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测创伤弧菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行4防污染措施防止污染措施应符合GB/T27403的规定，5缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine：甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase(large fragment)]:Bst DNA 聚合酶(大片段)CT(cholera toxin):霍乱毒素DNA(deoxyribonucleic acid）:脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导恒温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚Vuh A:cytolysin 溶细胞素基因 SN/T 2754.13—20116技术概要根据创伤弧菌属特有的靶序列基因(参见附录A)设计的特异性内引物、外引物和环状引物各一对特异性识别靶序列上的八个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在VvhA基因序列启动互补链合成,在同-链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环 DNA 混合物；从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据创伤孤菌属特有的靶序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物扩增片段长度：180bp。外引物 1(F3,5′-3）:GCGTCAATGTGGCACAGAT外引物 2(B3,5′-3):TGTAAGTGCGGCGGTTTG内引物1(FIP,5-3’):GGCATCGACGGTAAAGCGGACtttGTGCAATCAGCAACGTCAGA内引I物 2(BIP,5-3):GACAAGCCTGGCACGGGTATttttCCAA