SN_T 4545.1-2016商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法一.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4545.1—2016商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法Commercial kit methodSalmonella--Test method I2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4545.1--2016前言本部分是SN/T4545的第1部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：邵碧英、郑晶、董健、陈彬、黄晓蓉、彭华毅、林杰。1 SN/T 4545.1—2016商品化试剂盒检测方法沙门氏菌　方法一范围1SN/T4545的本部分规定了食品中沙门氏菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP)检测方法。本部分适用于家禽、鱼类和海产品、乳制品和杂品中沙门氏菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB19489　实验室　生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T2775商品化食品检测试剂盒评价方法SN/T3266食品微生物检验方法确认技术规范3生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌。所有培养物、DNA提取物和废弃物应按照GB19489和GB/T27403中的有关规定执行。4技术概要利用环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术进行沙门氏菌的筛选检测。根据沙门氏菌属特有靶序列上的6个独立区域，采用4条特异引物及一种链置换活性的DNA聚合酶，在65℃左右完成恒温扩增。在环介导恒温扩增反应中，产生肉眼可见的副产物焦磷酸镁乳白色沉淀，反应产物在荧光染料的作用下，阴阳性结果产生显色差异，即可通过颜色变化观察判定结果。5 试剂和材料5.1沙门氏菌核酸LAMP检测试剂盒本试剂盒参考SN/T2775和SN/T3266由国家认监委商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附录A。试剂盒组成如下：a）DNA 提取液。b）沙门氏菌HF反应管：为环介导恒温扩增反应管，每管内含22.5uL工作液（包括反应液及BstDNA 聚合酶），2μL 显色液和 50 μL稳定液。til SN/T 4545.1--2016阳性对照:沙门氏菌 DNA。c)d）阴性对照。试剂盒储存于一20℃以下，有效期6个月。试剂盒内各试剂使用前，充分解冻，并避免反复冻融。5.2沙门氏菌质控菌株实验室保存的沙门氏菌标准菌株或沙门氏菌标准菌株的DNA。6仪器和设备6.1移液器:量程 0.5 μL～10 μL;量程 10 μL～100 μL;量程 100 μl,～1000 μL。6.2高速台式离心机：转速不低于10 000r/min，最大相对离心力不低于7000g。6.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃±1℃。6.4计时器。7检测程序食品中沙门氏菌LAMP检测程序见图1。待测样品选择性增菌液或待测菌株细菌DNA提取LAMP反应结果观察1阴性阳性传统方法确认报告图1食品中沙门氏菌LAMP检测程序2 SN/T 4545.1—20168操作步骤8.1样品制备、增菌培养按照GB4789.4进行样品制备、增菌和分离。8.2细菌模板DNA的制备8.2.1增菌液模板DNA的制备对于从8.1获得的缓冲蛋白陈水增菌液，采用如下方法制备模板DNA：a）直接取该增菌液1mL加到1.5 mL无菌离心管中，10 000 r/min离心2min，尽量吸弃上清液；b）加人80 μLDNA提取液，混勾后沸水浴10 min，置冰上10 min;c）10 000 r/min离心2 min，上清液即为模板DNA作为试样待测；取上清液置一20℃可保存6 个月备用。8.2.2可疑菌落模板DNA的制备对于8.1分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照8.2.1b)步骤制备模板DNA作为试样待检测。8.3环介导恒温核酸扩增.:8.3.1空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应必须设置空白对照、阴性对照和阳性对照空白对照以水替代DNA模板。阴性对照和阳性对照可使用试剂盒中自带的，也可使用实验室自行制备的阴性对照和阳性对照。当使用试剂盒中阴性对照和阳性对照时，应定期进行核查。阴性对照制备:20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/