SN_T 4708-2016国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4708—2016国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法Detection method of vibrio cholerae and vibrio mimicus by duplexreal-time PCR at frontier ports2016-12-12 发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、浏涂层查真伪 SN/T 4708--2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：韩辉、杨宇、吴海磊、谭克为、宋亚京、李海山、徐宝梁。 SN/T 4708--2016国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌的检测方法，包括检测对象、样本采集和处理、操作方法及结果报告。本标准适用于国境口岸人出境人员、环境水体携带霍乱弧菌（包括01群、0139群和非01群/O139群霍乱弧菌）和拟态孤菌的分子生物学检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489-2008　实验室　生物安全通用要求WS233-2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(卫生部令第45号)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1霍乱弧菌 Vibrio Cholerae弧菌属，革兰氏染色阴性。病人和带菌者是霍乱的主要传染源，病人及带菌者的粪便或排泄物污染水源或食物后可引起霍乱暴发流行。霍乱有耐热的O抗原和不耐热的H抗原。根据O抗原不同，霍乱弧菌可分为200多个血清型，其中仅O1群和O139群霍乱孤菌产毒株可引起霍乱的流行。3.2拟态弧菌 Vibrio Mimicus弧菌属，革兰氏染色阴性。广泛存在于自然界河水、海水和海产品中。是一种人和水产动物共患病病原菌，可以通过水体和水产品感染人类，已经成为某些地区散发性和流行性腹泻及食物中毒的病原菌之一。拟态弧菌生化特性与霍乱弧菌极为相似，主要是引起人类急性腹泻。缩略语4下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链式反应DNA:脱氧核糖核酸DEPC:焦碳酸二乙酪FAM:6-羧基-荧光素，种荧光报告基团HEX:六氯-6-甲基荧光素，-种荧光报告基团 SN/T 4708—2016BHQ:黑洞淬灭基团5检测对象5.1疑似感染霍乱弧菌和拟态孤菌的人出境人员的生物样本，如粪便、呕吐物等。5.2疑似污染霍乱弧菌和拟态弧菌的环境样本，如人境船舶压舱水等。6生物安全要求6.1检测工作中的个人防护应按照GB19489—2008的要求进行个人防护。6.2实验室应遵循GB19489-—2008和WS233-~2002对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。6.3使用过的实验用品应遵照GB19489--2008对废弃物的处理要求进行无害化处理。6.4样本运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定。1仪器和设备7.1荧光定量 PCR仪。7.2生物安全柜。7.3普通冰箱。7.470℃及以下超低温冰箱。7.5普通台式离心机。7.6高速冷冻离心机（转速可达20000×g）。7.7涡旋器。7.8微量可调移液器（10 μL、100 μL、1000μL)及配套带滤芯吸头。8 试剂8.1生理盐水：蒸馏水和NaCl配制浓度为0.9%的生理盐水。8.2核酸提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）1）。8.3核酸抽提液（含0.9%NaCl和0.1%EDTA-Na²的混合液）。8.4　实时荧光 PCR试剂:用 TaKaRa公司的 Premix Ex TaqTM²’。8.5 DEPC水。8.6:实时荧光PCR引物及探针，如下：霍乱弧菌检测引物和探针：上游引物 FompW:5-TTGCTGCTAACGTTGGCTTTG-3下游引物 RompW:5′-CTGCTTTGTAGGTTGCCGTTG-3探针 PompW:5′-FAM-TGCTCAATGATAGCTGGTTCCTCAACGC-BHQ1-31）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 4708—2016拟态弧菌检测引物和探