SN_T 1681-2011蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1681-2011代替 SN/T1681—2005蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范Quarantine protocol for American foulbrood of honey bees2011-12-01 实施2011-05-31发布中华人民共和国(发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1681-2011前 言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准代替了SN/T1681一2005《蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法》。本标准与SN/T比，主要技术变化如下：-修改了标准的名称；1-增加了“现场检验检疫”“生理特征鉴定”及“PCR检测”内容；修改了原标准的“采样方法”“直接检查法”及“分离培养与鉴定”。本标准修改采用国际兽疫局（OIE)《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）中 2.2.2章，主要修改如下：原文中introduction”等内容经修改简缩后作为本标准附录A；原文格式及内容顺序排版上做了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、曾宪东、冯汉利、陈建军、赵晖、颜志立、朱堂明、王振华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1681--2005。 SN/T 1681—2011蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范1范围本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的现场检验检疫、采样、实验室诊断等检疫技术规范。本标准适用于进出境密蜂美洲幼虫腐臭病的检疫及本病的流行病学调查、诊断和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3试剂和材料3.1 幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae subsp.larvae)标准菌株由OIE参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。3.2引物3.2.1 PCR 引物上游引物:5-CTT GTG TTT CTT TCG GGA GAC GCC-3下游引物:5-TCT TAG AGT GCC CAC CTC TGC G-3扩增片段大小：1106bp。3.2.2巢式 PCR 引物巢式 PCR 外侧引物上游引物:5-TCG AGC GGA CCT TGT GTT-3下游引物:5-CTA TCT CAA AAC CGG TCA GAG-3扩增片段大小：969bp。巢式 PCR 内侧引物上游引物:5-CTT CGC ATG AAG TCA TG-3下游引物:5-TCA GTT ATA GGC CAG AAA GC-3扩增片段大小：572bp。3.3 Taq酶。3. 4 dNTPs:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。3.5 DNA Marker.3.6溴化乙锭。3.7 异丙醇。3.810 mmol/LTris · HCI-1 mmol/L EDTA 溶液(pH 8.0)。3. 9胡萝卜酵母琼脂培养基。3.10马铃薯培养基。3.11酵母浸膏培养基。 SN/T 1681—20114器材和设备4.1 PCR扩增仪。4.2电泳仪及电泳槽。4.3凝胶成像分析仪。4.4恒温培养箱。4.5高速冷冻离心机。4.6普通光学显微镜。5现场检验检疫临床变化特征结合病原鉴定是诊断密蜂美洲幼虫腐臭病的依据（参见附录A）。开箱，提蜂脾查看。出现下列病理变化特征之一者,可做出初步诊断。颜色变化：房盖潮湿、下陷、颜色发暗显油。通常，患病幼虫身体变软，虫体在患病1周内体色为白色至棕黄色，2周后为深棕色，3周后为棕黑色。死亡幼虫的头部朝向房盖，虫体顺着背部下塌，虫体由正常呈“C”型变为呈竖立姿势。患病幼虫残体1-个月后干,形成硬黑色的鳞片，紧贴巢房下侧，在310 nm～400 nm紫外光照射下可发出荧光。巢房变化：出现“插花子脾”现象，即后期房盖穿孔，巢脾上出现空巢房与卵房、幼虫房、封盖房相间排列的现象。丝状、粘性物：用一根火柴杆插人虫体可拉出长10em-15.cm、褐色、胶体状、有鱼腥臭味的细丝。蛹舌现象：蛹期发生死亡的蛹在蛹房顶部有蛹头突出的现象是美洲幼虫腐臭病典型的症状之-6采样按GB/T18088要求，采集蜂巢的病变区墩或疑似受感染的蜜蜂幼虫作为首选样品，亦可用蜂房(不小于20 cm²)或取临近蜂巢的蜜蜂食物(3gg～50g)作为样品7实验室诊断7.1病原形态学鉴定取幼虫5条～10条，置研钵中，加少量无菌水，制成悬液，取悬液涂片、风干、固定，加2滴5%孔雀绿加热至沸腾，待明水蒸于，用蒸馏水洗涤；再加0.5%番红染色30