SNT 1820-2006隐地疫霉菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1820—2006隐地疫霉菌检疫鉴定方法Identification of Phytophthora cryptogea Pethybridge Lafferty2006-11-10 发布2007-05-16 实施中华人民共和国糖Q15105发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1820--2006前言本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D 均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：谭群英、廖力、喻国泉、陈其文、张卫东。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1820—2006隐地疫霉菌检疫鉴定方法 范围1本标准规定了进出境植物检疫中隐地疫霉菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境植物及介质主中隐地疫霉菌的检疫和鉴定。2原理2.1分类地位隐地疫霉菌（Phytophthora cryptogea PethybridgeLafferty）属藻菌界（Chromista），卵菌门(Oomycota),腐霉目（Pythiales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉属（Phytophthora)。2.2检疫原理隐地疫霉菌的寄主植物很广，为害上百种经济作物，是非洲菊、翠菊、麝香石竹、圣诞花、番茄等植物的重要病原菌(参见附录A)。：主要以抗逆性很强的卵孢子在介质土中及寄主残体内越冬并长期生存，当田间温度和湿度适宜时，卵孢子打破休眠萌发，产生孢子囊。孢子囊在雨后或灌溉后有积水时，很快释放出大量游动孢子，最终通过幼根或伤口侵人寄主，可造成根、茎部腐烂，致使植物受侵染后叶片迅速萎枯死。2.3鉴定依据隐地疫霉菌在寄主植物上的症状、病原菌形态学特征、生物学特征是鉴定该菌的依据。3仪器设备及实验用具3.1仪器设备生物显微镜、体视显微镜、高压灭菌器、干热灭菌器、普通天平、分梳天平、超净工作台、生物培养箱。3.2实验用具酒精灯、医用手术剪、镊子、烧杯、培养血载玻片盖玻片、三角瓶、量筒、吸管、广口瓶。4 试剂氨苄青霉素（ampicillin）五氯硝基苯（PCNB）、次氯酸钠（NaCIO）苯莱特（benomyl）、多菌灵（carbendazim）、硝酸钙[Ca(NO）2］、磷酸三氢钾（KH,PO）、硝酸镁［Mg（NOs）］、氯化钙（CaClz）、利福平（rifampicin）碳酸钙（CaCO）、无水乙醇（ethanol)。5 培养基5.1:基础培养基用于隐地疫霉菌的保存和培养性状的观察、测定采用胡萝卜培养基(CA)、V：培养基(V:A)或利马豆培养基(LBA),其配制方法及步骤见第B.1章。5.2选择性培养基用于隐地疫霉菌游动孢子的萌发、病原菌的分离和纯化。1000mL基础培养基经常规灭菌并冷却到55℃左右时加人下列抗菌素（均为有效成分）：氨下青霉素 50 mg、利福平 20 mg、多菌灵 25 mg、五氯硝基苯 25 mg,摇匀，制成平血。在缺乏五氯硝基苯时可用相同药量的苯来特替代。1 SN/T 1820—20065.3液体培养基用于病原菌的液体培养以及产生孢子囊。采用皮氏培养液，其配制方法及步骤参见第B.2章。6实验室检验6.1病原菌检查选取有萎焉症状叶片，根部变褐腐烂植株，用解剖针挑取或刀片刮取病斑背面的霉状物或病组织制片，在显微镜下直接检查有无病菌的菌丝、孢子囊、卵孢子，记录其形态特征。6.2组织分离如果发现可疑症状，但不能从病部获得病原菌做“6.1”检查，应采取分离、培养的方法作进一步鉴定。选萎焉及根部变褐腐烂的植株,将病株在自来水下冲洗于净,在病健交界处切取 0.5 cm²左右的小块，用 70%酒精消毒 2 s～3 s后,置于 3%次氯酸钠(NaC1O)水溶液中消毒 3 min～5 min,再用灭菌水浸洗 3次，用灭菌滤纸吸干水分后移置选择性培养基，于25℃～28℃下培养5d。培养5d的菌丝块移人皮氏培养液中，在23℃～28℃、黑暗条件下培养3d～4d,倾去皮氏培养液，换上无菌水，并加人由打孔器制成的直径1cm非洲菊叶碟，每瓶10片左右。非洲菊叶碟以感病品种“鸡蛋黄”“粉色”的新鲜嫩叶制成为好，24 h～72h内取叶碟制片，于显微镜下观察菌丝及孢子囊形态特征。6.3土壤诱集将采集的土壤预先风干后，缓慢加人含有杀菌剂的无菌水，使其均匀湿润（含水量约35%），装在密闭的塑料袋中,25℃下 12 h光暗交替孵育 5 d～7 d诱导卵孢子萌发产生游动孢子囊。然后取 5 g～20g土壤磨碎放人烧杯,加混有杀菌剂的灭菌蒸馏水浸过土面1 cm～2 cm，用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣，每烧杯水面放直径1cm的叶碟10片左右。孵育2h后用消毒镊子将叶碟取出,并用无菌吸水纸吸干表面