SN 1501-2004野兔热病原分离鉴定操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1501--2004野免热病原分离鉴定操作规程Protocol of isolation and identification forpathogen of tularemia2004-11-17 发布2005-04-01实施中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1501—2004前 言本标准的附录 A、附录 B为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张常印、唐泰山、陈国强、姜焱、邓娟仙。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1501—2004野兔热病原分离鉴定操作规程1范围本标准规定了野免热病原(即土拉杆菌)分离鉴定操作方法。本标准适用于进出境动物及其产品的野兔热病原分离鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂3材料准备3.1器材3.1.1生物安全柜：安全级别在二级或二级以上。3.1.2玻璃试管：13mm×100mm圆底，洁净，同质。3.1.3试管架;与试管配套。3.1.4加样器(或1mL标准刻度移液管）：可调式或定量式(0.05mL～1.0mL)。3.1.5恒温培养箱：37℃。3.1.6生物显微镜。3. 1.7高压蒸汽灭菌锅。3.1.8接种针。3. 1.9F防护用具：乳胶手套、护目镜、口罩、外套和胶靴。3.2 试剂实验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。3.2. 1革兰氏染液：按GB/T4789.28配置。.3标准阳性血清：由指定单位供应。标准阴性血清：由指定单位供应。3.2.4#3.2.53%盐酸酒精：浓盐酸3mL加于95%酒精97mL中即成。3.3培养基弗朗西斯培养基，即葡萄糖半胱氨酸血琼脂：用蒸馏水或去离子水配制蛋白陈琼脂，加入0.1%3.3.1胱氨酸（或半胱氨酸)和1%葡萄糖，加热充分溶解，118℃～121℃15min。冷却至45℃～48℃，无菌加人5%脱纤兔、马、人或绵羊血液,充分混匀后，倒成平板。配制好的培养基在 4℃可保存8d～10d。由于胱氨酸或半胱氨酸)较难溶解，配制时可先用少量蒸馏水溶解，并加人少量氢氧化钠助溶，按比例配置后调节 pH 值。3.3.2McCoy和Chapin培养基，即凝固卵黄培养基：无菌采取 60g蛋黄，与40 mL生理盐水充分混匀，加热到75℃使其凝固即成，配制好的培养基在4℃可保存8d～10d。3.3.3生化培养基，按GB/T4789.28配制。 SN/T 1501--20044病原分离取濒死动物的心血、肝、脾、骨髓接种于弗朗西斯培养基或 McCoy和 Chapin 培养基,37℃培养 48 h后才有菌落形成。土拉杆菌在弗朗西斯培养基上生长良好，菌落融合，粘稠，呈灰白色，在 McCoy和Chapin培养基上形成凸起、圆形、透明状菌落。培养3周如无可疑菌落生长，可报告病原分离阴性。严重污染的病料，可参照5.4.2动物扩增试验方法进行病原菌扩增，之后再进行病原分离。病原分离及鉴定时的防护措施见附录A。5 病原鉴定5.1细菌培养物染色镜检取细菌培养物涂片，或发病动物的肝、脾、骨髓、肾、肺等组织压片，或渗出液、血液涂片，自然干燥后用3%盐酸酒精固定5min，水洗、干燥后作革兰氏染色镜检，如观察到革兰氏阴性，无芽胞、无鞭毛、不能运动,大小0.2 μm～0.7 um,以椭圆形为主的多形态球杆菌,则可初步判定存在土拉杆菌。5.2细菌生化试验取细菌新鲜培养物，接种生化培养基，分解葡萄糖、果糖、甘露糖迟缓产酸不产气，可由半胱氨酸或胱氨酸产生硫化氢(HzS)。在石蕊牛乳中培养2周生长微弱并呈弱酸性反应。触酶弱阳性，氧化酶阴性,不水解明胶,不产生吲哚。甲基红和VP试验阴性,不还原硝酸盐，可还原美蓝。本属细菌的另一些性状见表 1。表 1弗朗西斯菌属细菌的区别特征土拉热变种旧北区变种新杀弗朗西斯菌麦芽糖++蔗糖+一甘油++一石蕊牛乳微凝结(培养2周）+5.3凝集试验将分离细菌的老龄培养物悬浮于生理盐水中，制成菌体悬液，吸取0.5mL于试管中,加人0.5mL标准阳性血清,振摇 20 min 或 37℃孵育 1 h后，置室温下过夜后判定，出现凝集反应者为阳性。同时以标准阴性血清和生理盐水作对照。5.4动物试验5.4.1分离细菌的动物试验分离细菌18 h～24 h纯培养物皮下或腹腔注射接种小鼠，或脚趾部接