SCT 7206.3-2007牡蛎单孢子虫病诊断规程 第3部分：原位杂交诊断法.pdf

ICS 65.020.30B 41SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7206.3—2007牡蛎单孢子虫病诊断规程第3部分：原位杂交诊断法Diagnostic Protocols for Haplosporidiosis of Oyster--Part 3: in situ Hybridization Method2007-09-01实施2007-06-14发布中华人民共和国农业部发布 SC/T 7206.3-2007前言SC/T7206《牡蛎单孢子虫病诊断规程》分为三个部分：第1部分：组织印片的细胞学诊断法；一第2部分：组织病理学诊断法；第3部分：原位杂交诊断法。本部分为SC/T7206的第3部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：杨冰、黄健、陈爱平、江育林、王崇明、王秀华、魏琦、刘莉。1 SC/T7206.3—2007牡蛎单孢子虫病诊断规程第3部分：原位杂交诊断法1范围SC/T7206的本部分规定了牡蛎尼氏单孢子虫病的原位杂交诊断方法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分根据尼氏单孢子虫在组织中的定位与感染程度对牡蛎单孢子虫病进行确诊。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T7202.3-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法SC/T7205.1一2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法SC/T7206.1--2007牡蛎单孢子虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法3原理3.1牡蛎尼氏单孢子虫及其病理学特征见SC/T7206.1—2007（牡蛎单孢子虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法）中3.1的规定。3.2技术原理原位杂交检测方法是以非放射性标记物一一地高辛(DIG)标记的WSSV核酸探针与存在于切片中的WSSVDNA进行核酸分子杂交，并通过抗原－抗体反应和酶一底物的化学显色反应在组织切片上显示出WSSV的存在位点。原位杂交可完整地保持组织与细胞的形态，能在复杂的组织中针对单一细胞进行病毒检测，准确地反映出组织细胞中病毒的分布。4试剂和材料4.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.2寡聚核苷酸探针MSX1347:序列为：5-ATG-TGT-TGG-TGA-CGC-TAA-CCG-3，合成时用地高辛(DIG)标记的脱氧核糖核苷尿嘧啶残基(DIG-dU)代替脱氧核糖核苷胸腺嘧啶残基(dT)。4.3碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG,0.75U/μL,4℃）：生化试剂。4.4二甲苯。4.5无水乙醇。4.695%乙醇。4.7中性树胶：生物染色用。4.8石蜡（熔点52℃~54℃）：切片级4.9戴维森氏AFA(DavidsonsAFA)固定液按SC/T7202.3—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。1 SC/T 7206.3—20074.1080%乙醇按SC/T7202.3一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。4.1170%乙醇按SC/T7202.3一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。4.1250%乙醇按SC/T7202.3一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。4.13500μg/mL多聚赖氨酸按附录A的规定。4.142×SSC按附录A的规定。4.151×SSC按附录A的规定。4.160.5×SSC按附录A的规定。4.17TNE按附录A的规定。4.18100μg/mL蛋白酶K按附录A的规定。4.190.4%甲醛按附录A的规定。4.20杂交缓冲液按附录A的规定。4.21缓冲液I按附录A规定。4.22缓冲液I按附录A规定。4.23缓冲液Ⅲ按附录A规定。4.24缓冲液IV按附录A规定。4.25显影液按附录A规定。4.260.5%俾斯麦棕Y（BismarkbrownY)）按附录A规定。4.27阳性对照为受尼氏单孢子虫感染且组织病理学上有明显病灶的牡蛎组织切片（未脱蜡）。4.28阴性对照为未受尼氏单孢子虫感染且经原位杂交证明为阴性的牡蛎组织切片（未脱蜡）。5器材和设备5.1石蜡切片机：满足4um～7um厚度的石蜡连续切片要求。5.2