NY_T 2594-2014植物品种鉴定 DNA指纹方法 总则.pdf

ICS 65.020.01B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2594—2014总则植物品种鉴定DNA指纹方法General guideline for identification of plant varieties by DNA fingerprinting2014-03-24 发布2014-06-01实施中华人民共和国农业部-发布 NY/T 2594—2014目次前言-范围·12规范性引用文件3术语和定义4原理.5技术方法及检测平台6样品要求7试验程序8数据库构建9判定标准1 NY/T 2594—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：北京市农林科学院玉米研究中心、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：王凤格、易红梅、赵久然、吕波、堵苑苑、田红丽。Ⅱ NY/T 2594—2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则1 范围本标准规定了植物品种DNA指纹鉴定的基本原则、通用方法（或程序）及判定标准。本标准适用于植物品种DNA指纹鉴定方法的建立。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19557.1一2004植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1DNA指纹技术DNA fingerprinting technology由于不同品种间遗传物质DNA的碱基组分、排列顺序不同，具有高度的特异性，将能够可视化识别遗传物质DNA的碱基组分、排列顺序差异而区分不同品种的技术称为DNA指纹技术。3. 2简单重复序列simple sequencerepeat(SSR)类由几个核苷酸（一般为2个～5个）为重复单位组成的简单串联重复序列。根据其保守的边界序列设计引物，可通过PCR、电泳技术分析重复序列的重复次数变异。3. 3单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphism(SNP)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。3. 4核心引物coreprimer指品种DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性.作为统一用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定的引物，以保证不同实验室数据具有可比性3. 5 参照品种referencevariety对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段的大小，校正仪器设备的系统误差，以保证不同实验室数据具有可比性。4原理由于不同品种的基因组DNA存在核苷酸序列差异（如简单重复序列的重复次数差异或单核苷酸差异），这种差异可采用PCR扩增及电泳、芯片杂交、测序等检测手段获得的DNA指纹加以区分，从而对不同品种进行鉴定。5技术方法及检测平台5.1 DNA 指纹技术I NY/T2594—20145.1.1DNA指纹技术选择的基本原则a）标记多态性丰富；b)实验重复性好；c）数据易于标准化：d)标记位点分布情况清楚；e）标记为共显性；技术不受专利限制；g）技术成熟。5.1.2不同DNA指纹技术的选择基于上述原则，推荐SSR标记作为当前各植物品种DNA指纹鉴定的主要标记方法，SNP标记作为各植物物种重点研究的标记方法.适时推进。以下均是针对SSR标记所作的规范。5.2核心引物5.2.1核心引物的基本要求一套核心引物组合的选择标准a）引物位点间无遗传连锁；b）根据植物染色体数目的多少确定核心引物的最低数量，原则上每条染色体上应至少选择1对引物，并视不同植物物种的基因组大小及多态性水平确定合适的数量；引物扩增产物大小范围合适，具有多重扩增或多重电泳的潜力。c)单个核心引物的选择标准a）在所研究植物物种的不同品种间多态性高；b)能够准确区分不同等位变异，数据容易统计：c）非特异扩增片段少，结果稳定，重复性好；d）染色体分布情况清楚；e）突变率低；）避免选择零等位变异5.2.2核心引物的筛选评估及等位变异的确定引物筛选根据国内外研究文献、植物遗传信息数据库等列出的SSR位点及其多态性评价等信息·进行引物的初步筛选。每条染色体至少筛选40个多态性高、扩增效果好、退火温度一致的引物。对初筛出的候选引物采用一套代表性材料进行试验筛选。试验材料应包括代表不同遗传背景的若干材料（具体数量根据不同植物特点而定）、生产上主要推广种植的10个～15个品种及其亲本（对杂交种而言）和几套遗传近似材料。经过试验筛选，确定至少100对扩增效