SN_T 4649-2016瓜蔓枯病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4649—2016瓜蔓枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm2016-08-23发布2017-03-01实施中华民共和国人发布国家质量监督检验检疫总局O涂喜克钱 SN/T4649—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、石河子大学。本标准主要起草人：王瓣、张小菊、孙燕飞、张祥林、张伟、李亚伟、张瑜。 SN/T 4649--2016瓜蔓枯病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了瓜类蔓枯病菌Didymellabryoniae（Auersw.）Rehm的检疫鉴定方法。本标准适用于进出口瓜类植物种子、植株、果实中瓜类蔓枯病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1809进出境植物种子检疫规程3瓜蔓枯病菌基本信息学名：Didymellabryoniae（Auersw.)Rehm无性世代学名：Ascochytacitrullina（Chester）Smith有性世代学名：Didymellabryoniae（Auersw.）Rehm分类地位：瓜蔓枯病菌属子囊菌门（Ascomycota）、格孢腔菌目（Pleosporales）、隔孢假壳科（Didymosphaeriaceae）、亚隔孢壳属（Didymella）；无性态属球壳孢目（Sphaeropsidales）、壳霉科（Sphaeropsi-caceae）、壳二孢属（Ascochyta）。4方法原理瓜蔓枯病菌的症状表现、培养性状、形态学特征、致病性及PCR特异性扩增检测结果作为瓜蔓枯病菌的检疫鉴定依据。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备生物显微镜、体视显蔽镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。1%次氯酸钠，DNA提取相关试剂（盒），PCR相关试剂，电泳试剂。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)（配制方法见附录A）。1 SN/T4649--20166检验方法6.1取样和制样按照SN/T1809的方法抽取进出境瓜类种子样品。挑选皱缩、干癌、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒。对送检的植株茎部、叶部和果实进行检查时，选取叶片上呈现近圆形或不规则形的黑褐色病斑；茎部选取呈椭圆形或短条状褐色凹陷斑；果实选取圆形、暗褐色的凹陷斑，病斑表面呈星状开裂，内部呈木栓状干腐，发黑、腐烂的果实（参见附录B和附录C)进行病原菌的分离。6.2分离培养可将挑选出的可疑瓜类种子置于25℃保湿24h，再经一20℃下24h冷冻处理后用做培养。叶片、茎杆和果实样品可用无菌刀片切取病健交界处3mm～5mm左右的组织进行培养。病斑表面散生有黑色小点（病菌的分生孢子器）的，可以直接用挑针挑取移至培养基上培养。无菌条件下将供试材料用3%次氯酸钠表面消毒5min～10min，无菌水洗3次。将处理好的材料置于含青/链霉素微酸性的PDA培养基平板上，每Ⅲ放置3粒～4粒种子或5块～6块组织，于25℃下12h光照黑暗交替培养。培养第3天后开始观察，若发现乳白色或白色可疑菌落，立即用PDA培养基进行纯化。在无菌条件下挑取菌丝制片，于显微镜下观察菌丝和分生孢子形态。如无分生孢子产生，可在25℃的恒温箱中黑暗条件培养5d～7d，4d紫外灯照射（间隔12h），再2d暗处理后进行观察，并制片镜检。6.3PCR检测将分离出的病原菌，接种到PDA培养基上，25℃培养5d，挑取菌丝，用CTAB法或商业化试剂盒提取供试菌株DNA，进行常规PCR检测（参见附录D）。PCR扩增产物检测中，阳性样品应出现314bp的泳带。6.4致病性测定实验室首次检出该病菌需做致病性测定。将形态特征与瓜蔓枯病菌相符且PCR检测阳性的分离物进行致病性测定。用灭菌土播种健康瓜类种子，待长出3片～5片真叶后，用灭菌牙签或刀片在茎秆处穿刺或切开组织，用无菌打孔器在培养基上取瓜蔓枯病菌菌丝块，接种在伤口上，用湿润的脱脂棉包裹伤口，用塑料袋覆盖，28℃左右，相对湿度100%，黑暗条件下保湿48h，接种后5d～10d后观察接种点附近是否出现可疑病斑，观察症状并对发病子叶再做病原菌分离。鉴定再次分离到的病原菌是否与接种用菌为同一种。7鉴定特征该病菌在PDA培养基上的菌落边缘稀薄，中间稠密，略隆起，背面初为白色至黄色，后期变为黑色，正