SNT 1956-2007肉及肉制品中己烯雌酚残留量检测方法 酶联免疫法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1956--2007肉及肉制品中已烯雌酚残留量检测方法酶联免疫法Determination of diethylstilbestrol residues in meat andmeat product-Enzyme linked immunosorbent assay2007-08-06 发布2008-03-0.1实施中华人民共和国发布乱率层该 1查国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1956—2007言前本标准的附录 A 和附录 B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孙俐、郑文杰、唐丹舟、魏亚东、张宏伟。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1956--2007肉及肉制品中已烯雌酚残留量检测方法酶联免疫法1范围本标准规定了肉及肉制品中已烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉、猪肉饼中已烯雌酚残留量的检测。2试样的制备和保存2.1试样的制备从所取全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，采用四分法，将样品分成两等份，装人洁净容器，加封并做标识。2.2试样的保存试样放置－20℃～一18℃条件下保存3测定方法3.1方法提要本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应。已烯雌酚与已烯雌酚酶标记物共同竞争已烯雌酚抗体的结合位点，用酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，已烯雌酚浓度与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算。3.2试剂和材料除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯，戴为更高级别。水为重蒸馏水。己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒（参见附录 A)。3.2.13. 2. 2叔丁基甲基醚：色谱纯。3.2.3石油醚。3.2. 4二氯甲烷。3.2.5磷酸。3.2.6盐酸。3.2.7甲醇：色谱纯。3.2.8磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H,O)。磷酸二氢钠(NaH,PO4·H²O)。. 10氯化钠。3.2. 11三羟甲基氨基甲烷。 磷酸盐缓冲液(67mmol/L,pH7.2):称取 9.61 g磷酸氢二钠,1.79g磷酸二氢钠和8.7g3.2. 12氯化钠溶解于并定容至 1000 mL水中。3.2.13Tris缓冲液(20 mmol/L,pH=8.5):称取 2.42 g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 700 mL水中,加入200 mL甲醇,用5mol/L盐酸调节 pH值至8.5,加水定容至1000mL。3.2.14洗涤用磷酸盐缓冲液（20mmol/L,pH一7.2)：称取2.85g磷酸氢二钠0.55g磷酸二氢钠，9g氯化钠和1mL吐温20,溶解并定容至1000 mL水中。3.2.15氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠溶于1000mL水中。 SN/T 1956—20073.2.16已烯雌酚标准品：标准品纯度≥98%。3.2.17已烯雌酚标准品溶液的配制：准确称取适量的已烯雌酚标准品，用甲醇配制成1mg/mL标准贮备溶液，于4℃～8℃条件下保存。3.3仪器和设备3.3.1酶标仪：波长 450 nm。3.3.2高剪切分散器。3.3.3涡旋振荡器。3.3.4　天平。3.3.5离心机:3 000 r/min。3.3.6氮气吹干仪。3.3.7洗板机。3.3.8固相萃取仪。3.3.9水浴锅：70℃±2℃。3.3.10微量加样器:20 μL,50 μL,100 μL,200 μL。3.3.11微量多通道加样器：50μL，100μL。3.3.12 RIDA Cis柱:100 mg,1 mL。3.4样品处理3.4.1试样提取称取 5.0g试样至离心管中,加人10 mL 67mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液,均质,用 8mL叔丁基甲基醚提取3.0g均质物，强烈振荡20min,3000 r/min离心10min。转移出上清液，再用8mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物,将两次提取的醚相合并,70℃水浴蒸发至干。用1 mL 70%甲醇溶解干燥的残留物，用3mL石油醚洗涤甲醇溶液，均质15s，3000r/min短时离心，吸除石油醚。70℃水浴蒸干甲醇溶液，用1mL二氯甲烷溶解,用3mL氢氧化钠(NaOH)溶液提取。用300μL6 mol/L磷酸中和提取液。3.4.2样品纯化用 RIDA Cis柱纯化,流速均为1d/s。用3mL无水甲醇洗涤柱子，用2mL20 mmol/L pH8.5的Tris 缓冲液平衡柱。将上述中和提取液加人柱中,用2 mL 20 mmol/L pH 8.5 的 Tris 缓冲液洗涤柱，用 3 mL 40%甲醇洗涤柱子,用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹 2 min 以干燥柱子。用1 mL80%甲醇洗脱样品，用1mL80%甲醇稀释洗脱液，加人2mL蒸