基因工程第五章载体.pptVIP

第一页，共三十七页，2022年，8月28日 载体的概念：载体是基因工程中携带目的基因进入宿主细胞，可自我或随同宿主DNA的复制而复制，及表达的工具。 载体的条件： 含有复制子：这是一段具有特殊结构的DNA序列，载体有复制起始位点，才能携带外源基因进入宿主后，进行复制，保证子代细胞仍含有外源基因。 有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。如抗药性、显色表型、营养缺陷型、荧光表型等. 有一个或几个限制性酶切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。 适当的拷贝数。高拷贝数不仅利于载体的制备，也有利于克隆基因的剂量的增加。 载体的分类：质粒载体――可容纳15KB的外源片断 噬菌体载体――25－45KB 人工染色体－－45KB以上 第二页，共三十七页，2022年，8月28日 质粒是一种可进行自我复制的并能独立传播的DNA的一种存在形式，并且自然界中原核生物、真核生物大部分都发现有质粒的存在，所以质粒现在是应用最广的载体 第三页，共三十七页，2022年，8月28日 plasmids Section one 第四页，共三十七页，2022年，8月28日 一、质粒的生物学特性： 质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的双链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复制并保持遗传恒定的复制子，大小在1――200KB。质粒常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如说抗性基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且可赋予微生物特殊的外形―――鞭毛、菌毛、芽孢等。 第五页，共三十七页，2022年，8月28日 如:大肠杆菌中的F质粒、R质粒、COL质粒。 F质粒：又叫性质粒，他的存在决定大肠杆菌的性别，含有F因子的菌株有一个特殊的结构――性菌毛。 R质粒：又叫抗性因子，他们含有一种或几种抗生素的抗性基因，编码一些酶类，可对抗生素进行修饰和降解。这样一旦微生物具有了抗性质粒，就出现对抗生素的抗性。1959－1960年日本人发现了抗药性因子。另外除了抗药特点外，有的质粒具有抗砷、汞、银等重金属的特性，有的抗紫外等射线。 COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种奇怪的蛋白质抗菌物质――大肠菌素。 第六页，共三十七页，2022年，8月28日 如何识别微生物是不是含有质粒？ 首先要看微生物的形态（同种微生物形态不同，可能含有），其次要从细胞中提取质粒。如荧光假单孢菌。具有质粒的均有分泌抗生素的特性。 第七页，共三十七页，2022年，8月28日 二、质粒的遗传学特性： 1. 质粒DNA闭合的环状分子： 迄今发现的大部分质粒都是环状分子，也有线性的。 质粒分子三种存在形式：（主要与复制有关） 共价闭合超螺旋形式：（covalently closed circular，简写cccDNA） 开放环结构：一条保持着完整的环结构，另一条有一个或数个切刻。 线性结构：质粒在限制性酶作用下，双链断裂，形成线性，又叫L型。 克隆只有超螺旋可用。 第八页，共三十七页，2022年，8月28日 2. cccDNA分子分离特性： 由于cccDNA分子团压成一个紧密的结构，当我们用EBr、丫啶橙染料分子作用后，线性分子染料插入的分子个数多，cccDNA插入的分子个数少，密度大，所以沉降系数大，进行密度梯度离心时可将其分开 cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中沉淀下来。 第九页，共三十七页，2022年，8月28日 3. 质粒DNA的分子量和拷贝数： 按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒，他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。 拷贝数是受一个定位在叫cop基因编码的阻遏物的控制，质粒个数增加，合成的阻遏物的浓度增加，从而阻止质粒的进一步合成。不像病毒DNA进行无限制的合成，直到细胞裂解。 第十页，共三十七页，2022年，8月28日 4. 质粒DNA的复制类型： 根据质粒复制所受控制的方式和在寄主细胞所含质粒拷贝数的多少： 松弛型：质粒的复制可自由完成，自身可编码与复制有关的功能蛋白，所以在细胞的生命周期中，可随时进行自我复制，所以松弛型的拷贝数多，每个细胞中由10－200个不等。