怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生.docxVIP

怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生 甘薯是科的一种多壳类药物。它是中国道教和著名的四大经典之一，主要产于河南省文县、武港和沁阳。怀山药药食兼优具有降糖降脂、增强人体免疫力及抗衰老等功能,素有“怀参”之称,其产品畅销国内外。目前,传统的山药种质资源保存仍采用大田种植的方法,不仅需要大量的人力、物力和财力,而且还不可避免地受到各种自然灾害(如病虫害、干旱、低温等)和人为失误(疏于管理、挂错标签等)的影响,最终可能造成特有种质的遗失或混杂。因此,探索怀山药种质资源离体保存的方法具有十分重要的意义。 包埋玻璃化超低温保存是20世纪90年代中期兴起的一种新的超低温保存技术(Matsumoto et al.1995)。该技术兼具玻璃化和包埋脱水超低温保存的优点,具有对材料的毒害性小、所需设备简单、易于操作、脱水时间短、恢复生长快等优点,在植物种质资源保存上显示出巨大的应用潜力(吴雪梅和汤浩茹2005)。目前该技术已应用于苹果(Malus domestica)(Paul et al.,2000)、枳橙(Poncirus trifoliate)(Wang e al.,2002)、甘薯(Ipomoea batatas)(Hirai and Sakai,2003)、非洲紫罗兰(Saintpaulia lonantha)(Moges et al.,2004)、葡萄(Vitis spp.)(Wang et al.,2004)、悬钩子(Rubus idaeus)(Wang et al.,2005)、怀地黄(Rehmania glutinosa)(李明军等,2008)、铁皮石斛(Dendrobium candidum)和黄独(Dioscorea bulbifera)(Yin and Hong,2009,2010)等植物上。近年来,本实验室对怀山药种质玻璃化超低温保存进行了系统的研究(李明军等,2006;Li et al.,2009),在此基础上又进一步探索包埋玻璃化超低温保存技术及应用,旨在为怀山药种质资源的离体保存提供一条新的途径。 1 材料和方法 1.1 培养细胞的基因型 供试材料为铁棍山药(Dioscorea opposita‘Tiegun’)、太谷山药(D.opposita‘Taigu’)、怀庆1号山药(D.opposita‘Huaiqing No.1’)和B号山药(D.opposita‘No.B’)4种基因型怀山药继代培养60天的试管苗。 1.2 方法 1.2.1 低温疲劳 怀山药试管苗于低温下分别炼苗0、3、5、7、15和30天。 1.2.2 ms/ms培养基 在无菌条件下,切取带芽茎段,放入含MS+0.1mol·L–1蔗糖(Suc)+0.1 mol·L–1甘油(Gly)培养基中,低温下预培养3天。 1.2.3 有效包埋moll–1suc的ms培养基 将材料切成2 mm左右的带芽茎段,室温下与含3%海藻酸钠和0.2 mol·L–1Suc的MS培养基混合,将混合液滴入含有0.5 mol·L–1Ca Cl2和0.2 mol·L–1Suc的MS培养基中进行包埋,获得球形包埋珠。每个包埋珠含1个材料。 1.2.4 moll–1mol-1工艺-1,8-1-甲基-1,8.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,5.2,7,5.2,7,5,7,7,7,5.2,4.3,4.2,4.3,4.2,4.2,4.2,4.2,4.3,4.4,7,5.2,4.4,5.2,4.4,5.4,5.2-二甲基亚7.2,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7.4,7. 将包埋珠分别放入3种不同的装载液中,装载液配比分别为MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly、MS+0.2mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly+30 g·L–1甘露醇(Man)和MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly+50 g·L–1二甲基亚砜(dimethyl su