越冬红嘴鸥及栖息环境部分动物弓形虫流行情况分析.docx

? ? 越冬红嘴鸥及栖息环境部分动物弓形虫流行情况分析 ? ? 董 路 何紫薇 程文杰 杨建发 代飞燕 邹丰才 杨林富 (云南农业大学动物医学院，昆明，650201) 刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)属于球虫亚纲，弓形体属，是一种地域分布广泛且宿主众多的重要人兽共患寄生虫，是能够感染所有温血和少数冷血动物的胞内寄生性原虫[1]。鸟类(Aves)及几乎所有的哺乳动物(Mammalia)，甚至一些水生动物都有可能成为弓形虫的中间宿主[2]。弓形虫也极易感染人(Homosapiens)，据调查显示全球约有30%的人感染弓形虫，我国人群平均阳性率为7.88%[3]。人可通过食入被弓形虫卵囊或包囊污染的食物和水源感染弓形虫[4]，或是长期与宠物粪便接触或清洁不当也会导致感染。弓形虫病的危害极大，可造成孕妇早产、流产和胎儿发育畸形等，也是免疫缺陷症患者的主要死亡原因之一。同时该病对鸟类的感染会增加周围人群感染弓形虫的风险，尤其会给禽类养殖户带来严重的经济损失，并且对生态环境也会造成潜在的危害。 红嘴鸥(Chroicocephalusridibundus)是中国内陆及沿海地区最常见的中型候鸟之一，属于鸻形目(Charadriiformes)鸥科(Laridae)鸥属，因其嘴和脚皆呈红色，故称为红嘴鸥[5-6]。红嘴鸥属“三有”保护动物。红嘴鸥每年10月下旬，分别从新疆博斯腾湖、俄罗斯西伯利亚地区的贝加尔湖、蒙古国乌布苏湖区域3条路线迁移至云南，次年3月再飞回北方[7]。迁徙至云南过冬的红嘴鸥主要食取鱼虾(占进食量的95%)，昆虫(4%)，植物性食物(1%)[8]。其在昆明比较集中的几个栖息地即滇池、翠湖公园[9]、环西桥，玉溪抚仙湖等，其栖息环境正好是老鼠、流浪猫等动物的出没频繁之地，并且在滇池周边村落还存在有散养鸡饲养的情况，这几种动物都是弓形虫传播的重要中间或终末宿主，这势必为红嘴鸥感染弓形虫提供了条件。目前，关于滇池红嘴鸥感染弓形虫的相关报道仍较少。为了解迁入云南滇池越冬的红嘴鸥弓形虫感染情况，本调查选取滇池红嘴鸥为主要研究对象，并对周边红嘴鸥栖息环境中的褐家鼠(Rattusnorvegicus)、散养土鸡(Gallusgallusdomestiaus)等动物的弓形虫感染情况进行调查研究。明确红嘴鸥弓形虫的感染时间和感染源，为迁徙候鸟弓形虫病溯源、预防、诊疗等提供参考依据。 1 材料方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集 于2017—2019年，从昆明滇池共采集到红嘴鸥血液样品403份，分离得到血清386份。此外，分别从玉溪市江川县江城镇、昆明市海口镇和晋宁区晋城镇、昆阳镇采集周边环境动物样品162只，其中褐家鼠128只，散养土鸡34只，解剖取其心、肝、肺、肾、脑、肌肉等组织样品放置-20℃冰箱保存备用。 1.1.2 主要试剂 弓形虫间接血凝实验(IHA)试剂(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)、基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、dNTPs(购自大连宝生物工程有限公司)、2×TaqPCR Master Mix、rTaqDNA聚合酶等。 1.2 方法 1.2.1 间接血凝实验(IHA)检测红嘴鸥弓形虫抗体 在一次性96孔110°V型塑料反应板上进行弓形虫抗体检测，加样前在反应板上做好样品编号的标记，实验操作和结果判定标准严格按照检测说明书进行。 1.2.2 弓形虫镜检观察 将采回的褐家鼠、农户散养土鸡样本进行解剖后，分别挑取脑组织充分研磨，加入少量生理盐水。吸取约20 μL脑组织悬液滴涂在载玻片上，镜检观察是否存在弓形虫病原体。 1.2.3 巢式PCR检测弓形虫病原 1.2.3.1 全基因组DNA提取 按照DNA提取试剂盒说明书提取各动物全基因组DNA。并将提取的DNA 保存至-20℃备用。 1.2.3.2 巢式PCR扩增弓形虫B1基因 扩增引物参照Alfonso等[10]所报道的B1基因引物序列，并优化其扩增体系和条件，预期扩增目的片段大小为530 bp，引物序列如下： (1)外引物 B1-F1：5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′ B1-R1：5′-ACGGATGCAGTTCCTTTCTG-3′ (2)内引物 B1-F2：5′-TCTTCCCAGACGTGGATTTC-3′ B1-R2：5′-CTCGACAATACGCTGCTTGA-3′ 1.2.3.2.1 巢式PCR扩增体系及条件 在200 μL灭菌PCR管中依次加入灭菌ddH2O(第一轮、第二轮分别为9.5 μL、10.5 μL)、上游引物、下游引物各0.5 μL、2×TaqPCR Master Mix12.5 μL和模板DNA(第一轮、第二轮分别为2 μL、1 μL)，混匀后瞬时离心，PCR扩增反应总体系为25 μL。