酵母操作手册--Leader-in-Biomedicine-RD-Outsourcing.docVIP

酵母操作手册--Leader-in-Biomedicine-RD-Outsourcing 酵母操作手册 （一）酵母的冻存、复苏以及培养 注：本手册改编自商业化酵母操作方案，依据本实验条件修改，并不适合所有实验室！ 培养基配方： 10X Dropout 粉剂（1L） AA Name 所购数量 ( g ) 10X 浓度 (mg/L) 实称 （g） L-Isoleucine 5 300 0.3 L-Valine 25 1500 1.5 L-Arginine HCl 50 200 0.2 L-Lysine HCl 50 300 0.3 L-methionine 10 200 0.2 L-Phenylalanine 10 500 0.5 L-Threonine 10 2000 2 L-Tyrosine 25 300 0.3 L-Uracil 25 200 0.2 共计 5.5 将各AAs称量后，在研钵中磨合混匀，置于干净器皿中。 单独用AA筛选溶液 AA名称 体积 ( ml ) 浓度（mg/ml） 实称 （g） L-Adenine hemisulfate salt 100 2 0.2 100 X L-Histidine HCl monohydrate 100 2 0.2 100 X L-Leucine 100 10 1 100 X L-Tryptophan 100 2 0.2 100 X 过滤除菌 YPDA（1L） 浓度 实称 （g） Difco peptone 20 g/L 20 Yeast extract 10 g/L 10 Agar (for plates only) 20 g/L 20 Glucose 2% 20 Adenine hemisulfate 0.003% 15 ml 0.2%Ade SD Media （1L） 浓度 实称 （g/ml） 加H2O至1000ml, 114℃，20min YNB 6.7 g Agar(for plates only) 20 g Glucose 2% 20 10X基本DO 粉剂 0.55 g 100X单独用AA 10 ml 1． 长期冻存： 无营养缺陷型的酵母株存在含25％甘油的YPDA中，然后冻存于-70℃冰箱中，若要保存大于一年，务必使温度不要低于-55 转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25％甘油的相应的缺陷型培养基（SD）中，以避免质粒丢失。 制备方法： 质粒DNA可以用常规方法制备，，转化酵母时没必要对其进行进一步的纯化。因为RNA在LiAc/SS-DNA/PEG转化过程中，RNA本身就是一个很好的载体（Carrier），所以不需要在制备DNA时除去RNA。 我们在实验中常用碱裂解法大提质粒，但LiCl处理可以免去，TE中也不加RNase。 常规转化酵母细胞手册 1．将酵母接种在2 – 5 ml YPDA或10 ml 极限培养基中，于30℃、200rpm培养18至20h 2．取少许在显微镜下计数，使酵母浓度在108/ml左右。 计数时注意： 1．取少许酵母用水稀释10倍或100倍（假设为10倍） 2．小心地取10μl置于计数板和盖玻片之间，使其虹吸进入两者中间的带格空隙中，静置几分钟。格子区域为1平方毫米，它被分为25个正方形，计数板和盖玻片之间的体积相当于10－4ml。 3．计5个正方形方格中酵母的数量（假设为239个） 4．按如下方法计数：5个方格中的酵母数 X 稀释倍数 X 1/25个正方形方格所占的体积。所以按3中所计之数，应该为239 X 5 X10 X 1/10－4 = 1.2 x 108个酵母/ml。 5．芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）通过芽殖来进行繁殖，计数时出芽的酵母只能算是一个细胞，如果出的芽与原来的细胞等大，可以算作两个。有些酵母系会形成团块，导致铺平板时克隆数减少，因为一团细胞只能长成一个克隆，这使得下一步的分析变得困难。 6．我们也可以用OD600来确定酵母的浓度，但不同的酵母株中，这种细胞数与OD600之间的关系也不同。 3．取已在30℃预热的YPDA（50ml），加入2中的酵母细胞，使酵母浓度在5 x 106/ml 4．30℃，200rpm振荡培养，使酵母细胞浓度到2 x 107/ml。这大约得花3至5小时。这些培养物足可以做10 注意：I：务必使细胞至少分裂两次 II：转化效率（转化子/μg质粒/108酵母细胞）在第3至第4个分裂期之间保持稳定。 5．用50ml离心管于4℃，3000g（约5000rpm）离心5 6．倒去上清，用25ml无菌水重悬，再次离心。 7．倒去水，用1ml 100mM LiAc重悬，转移到1.5ml离心管中。 8．在微量离心机上，以最高速度（14,000rpm）离心15秒，用枪头小心