阻断剂IgG多聚工艺.pptxVIP

阻断剂IgG多聚工艺1 背景特异性干扰主要由嗜异性抗体（人抗动物抗体）引起，能够导致明显的假阳性或假阴性结果。据报道，特异性干扰可发生在30-40％的患者样本中。这些嗜异性抗体可以是IgAs、IgEs、IgGs、IgMs或Ig(n)。它们可能是多聚体或单体并且浓度范围很广。但是，它们均直接针对检测系统的特异性抗体。由于多数免疫诊断检测采用单克隆小鼠抗体，因此人抗小鼠抗体（HAMAs）是引起检测干扰的主要原因。MAK33系列产品是应用广泛的干扰消除蛋白（IEP） 背景MAK33系列产品是应用广泛的干扰消除蛋白（IEP）罗氏的MAK33系列产品包括单价IEPs（MAK33 IgG1、MAK33 Framework IEP等）和多价IEPs（MAK33 IgG1/IgG1 Poly、MAK33 IgG1/Fab1 Poly等）。 背景不同的干扰类型适用不同的干扰蛋白罗氏的HAMA血清竞争检测数据表明，MAK33 IgG1/IgG1多聚体对多价干扰非常有效，对更高特异性和单价干扰样本也有不错的消除效果。 MAK33 IgG1/IgG1多聚体的制备方法1、化学交联MAK33 IgG1/IgG1 Poly2、热聚合MAK33 IgG1/IgG1 Poly 一、化学交联工艺参考专利：Lenz H, Mossner E, Stock W, Roder A, Haug H, McCarthy RC, inventors. Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate. (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim DE, assignee). US Patent 164054 (4914040),April 3, 1990. 1.1 戊二醛交联MAB33-IgG溶于0.025M碳酸缓冲液（pH 9.5）,加入17μl 12.5%戊二醛溶液，25℃反应2h，冰上冷却，调节pH至8.1，加入硼氢化钠反应2.5h（0℃），4℃用10mM PBS透析16h。透析液超滤浓缩，粗产物可直接用于干扰实验。进一步纯化：用AcA22填料柱纯化粗产物，洗脱液为10mM 磷酸盐/100mM NaCl(pH7.5)，分别收集不同分子量的聚集物。 一、化学交联工艺1.2 巯基-马来酰亚胺交联引入马来酰亚胺：MAB33-IgG-MH 100mg MAB33 溶于30mM PBS溶液（Ph 7.1），加入20μl（4 μ moles）0.2M 的（N-马来酰亚胺甲基）己酰琥珀酰亚胺酯（Maleicimidohexanoylsuccinimidate）（DMSO溶液），25℃反应1h，在4℃用PBS（ pH6.1）透析16h，获得MAB33-IgG-MH产物。引入巯基：100mg MAB33溶于4mL 0.1M PBS(pH8.0)，加入40 μl 0.025M的S-乙酰巯基丁二酸酐，在25℃反应1h，在4℃用PBS（ pH6.1）透析16h，获得MAB33-IgG-SAMS产物；该产物（50mg）用25mM PBS（pH6.5，含2mM EDTA，buffer A）稀释至15mg/mL，加入75μl 1M羟胺溶液，25℃反应20min，获得带巯基的MAB33-IgG-MS。巯基-马来酰亚胺偶联：44mg MAB33-IgG-MS用buffer A稀释至6mL，加入4mL含88mg的MAB33-IgG-MH，25℃反应40min，接着加入半胱氨酸（2mM）终止反应，25℃反应30min，加入N-甲基马来酰亚胺至5mM继续反应1h。最后在PBS中透析（pH7.5）。产物超滤浓缩直接使用，或纯化获得不同分子量馏分。 一、化学交联工艺1.3 葡聚糖骨架偶联MAB33多聚体巯基葡聚糖制备：葡聚糖（100mg Dexan T40，分子量40kD，28个氨基酸）溶于4mL 30mM PBS溶液（pH 7.1）中，加入0.25mL 0.2M的SATA（DMSO溶液），25℃反应1h，用10mM PBS（ pH6.1，含50mM NaCl）透析。取2mL乙酰基巯基乙二酰-葡聚糖溶液（20mg/mL），用NaOH调节pH至6.5，接着加入EDTA至2mM；然后加入40μl 1M羟胺水溶液，25℃反应20min。接着用25mM 的PBS溶液（pH 6.5）稀释至6.8mL。巯基葡聚糖-MAB33-IgG-MH偶联：上述巯基葡萄糖溶液加入158.4mg MAB33-IgG-MH，25℃反应30min，加入半胱氨酸至2mM，25℃处理30min后，加入N-甲基马来酰亚胺至5mM继续反应1h。产物在10mM PBS（pH 7.5，含5