《药学微生物技术》项目4 检测病毒.pptxVIP

化学工业出版社在线教育平台; 半数感染量（50% infective dose，ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小微生物量。 半数鸡胚感染量 ( 50% egg infective dose，EID50) 半数细胞培养物感染量（50% cell culture infective dose CCID50) ; 系用甲型和乙型流行性感冒病毒株分别接种鸡胚，经培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩和纯化后制成。 甲型和乙型流感病毒株的病毒滴度采用鸡胚半数感染剂量法（EID50）检查，病毒滴度应不低于6.5 lg EID50/mL。; 系用腮腺炎病毒减毒株接种原代鸡胚细胞，经培养、收获病毒液后，加适宜稳定剂冻干制成。用于预防流行性腮腺炎。; 腮腺炎减毒活疫苗成品的病毒滴定则应不低于5.0 lg CCID50/mL。; 系用麻疹病毒减毒株接种原代鸡胚细胞，经培养、收获病毒液后，加入适宜稳定剂冻干制成。用于预防麻疹。 《中国药典》规定生产用毒种的病毒滴度应不低于4.5 lg CCID50/mL。 疫苗成品的病毒滴度应不低于3.3 lg CCID50/mL。;实例：测定鸡新城疫活疫苗的半数鸡胚感染量 (50% egg infective dose，EID50）;1、接种鸡胚? 选取10-5、10-6、10-7三个稀释度的病毒尿囊液，接种9～11d SPF鸡胚5枚，接种量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，逐日观察至5天，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别测定血凝效价。 ;2、检测血凝效价;3、血凝效价的结果 病毒的血凝效价以使50%红细胞发生凝集的病毒液的最高稀释度来表示，测定结果下表。血凝效价≥1:160者，判为感染。;（三）根据血凝效价计算EID50 ;按Reed-Muench法计算EID50 EID50的对数=距离比例×稀释系数的对数差＋高于50%病毒稀释度的对数 距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）÷（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）;距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）÷（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ＝（71%-50%）÷（71%-29%）＝ 0.5;? ??? 本例高于50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.5，稀释系数的对数差为-1。 EID50的对数=距离比例×稀释系数的对数差＋高于50%病毒稀释度的对数 则： lg EID50=0.5×（-1）＋（-6）=-6.5 即： EID50=10-6.5/0.1ml 表示：将病毒悬液作10-6.5稀释后，给鸡胚接种0.1mL，可以使50%的鸡胚感染。 ; 在生产实践中，通过EID50检测，当尿囊液中病毒的EID50≥10-6.5时，方可作为制备疫苗的病毒液，达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理。;化学工业出版社;化学工业出版社在线教育平台;将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂， 由于琼脂的限制，当病毒从感染的细胞释放出来，琼脂阻止病毒扩散并感染临近的细胞。 当细胞被损伤或杀死，在细胞单层上溶解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成。;空斑形成后，经中性红活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞不着色，形成不染色区域。 每个空斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位 (plaque forming unit, PFU)。 计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的病毒感染单位的浓度。 ;适用条件：凡是能在细胞中产生细胞病变效应的病毒都可以采用空斑形成法测定病毒滴度。病毒的生产及病毒抗原制备，即疫苗生产过程中经常用来测定病毒滴度。 ;1、病毒性疫苗的稀释 取鸡马立克氏病活疫苗疫苗3瓶，分别用乳汉液稀释。;2、病毒的细胞接种 取适当稀释度，每个稀释度接种3个已长成良好单层细胞的细胞培养瓶。 将长成单层致密的鸡胚成纤维细胞液倒掉，用PBS反复清洗3次，将死亡或脱落的细胞洗掉。;每瓶加入0.2mL病毒稀释液，使病毒液充分铺满瓶底。 在37～38℃吸附60分钟，加入含2％牛血清的199营养液，继续培养24小时。 ;弃去营养液，覆盖含5％牛血清的199营养琼脂，每瓶加3mL。 待凝固后，将瓶倒置，继续培养5～7日，进行蚀斑计数。;3、蚀斑计数 蚀斑应典型、清晰，形态不规则，边缘不整齐，直径0.5～1.5mm，呈乳白色，与同时设立的参照品蚀斑一致。;3、蚀斑计数 计数时，一般选蚀斑数在30～150个之间的细胞瓶进行计数，用肉眼观察，以蜡笔或记号笔在瓶底面点数，求出同一稀释度3瓶的平均蚀斑数，计算出每瓶