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冷冻电子断层成像的研究现状与发展趋势 0 膜蛋白结构解析 冷冻电视法和三维重建技术在结构生物学领域的应用迅速，已取得重要进展。与X-射线晶体学和核磁共振波谱学(NMR)等传统的测定蛋白质分子三维结构的方法相比较,它具有以下几个方面的优势:1)保持生物样品的活性和功能状态;2)无须制备晶体,特别适合难于结晶的大分子及其复合物的三维结构判定;3)结合新型的电子显微镜、制样机器人等设备和技术,可以实现显微制样、数据收集、三维重构全过程的自动化或半自动化,为高通量、快速解析大分子及其复合物的三维结构打下基础。 利用冷冻电镜技术进行三维重构的主要方法有:单颗粒分析(single particle analysis SPA)方法,电子晶体学(electron crystallography)方法,和电子断层成像(electron tomography,ET)方法。其中电子晶体学方法较多用于一些膜蛋白结构的解析,其解析的结构可以达到很高的分辨率,但要得到蛋白的二维晶体仍然是一个非常具有挑战性的工作。单颗粒分析方法适用于具有结构同一性的样品,通过采集大量单个颗粒的二维投影图来重构三维结构,是冷冻电镜三维重构发展最快也是最主要的结构解析方法。利用单颗粒电镜重构技术已经解析出了很多生物大分子、病毒以及复合物的结构,目前的最新研究成果已经可以在准原子或原子分辨率下解析具有高度对称性的病毒分子结构,最高精度已经达到约3.3魡左右。在准原子分辨率下,许多结构上的细节都清晰呈现,并使得建立基于冷冻电镜密度图的独立原子模型(de novo modelling)成为可能。对于不具有对称性的大分子复合体,其结构解析的分辨率也在迅速提高。另外,利用单颗粒分析方法解析各种重要功能的分子机器(molecular machine)在不同功能状态下的结构,以及利用其进行重建结果的多变量统计分析以确定生物大分子复合物不同的构象与结构异性也是目前研究的热点。 电子断层成像通过获取同一区域多个角度的投影图来反向重构所研究对象的三维结构,适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。与蛋白质电子晶体学和单颗粒技术相比,这种技术无需样品颗粒具有结构同一性,也不强调样品具有一定的对称性。因此,虽然目前电子断层成像所获得的结构的分辨率(约4~10纳米)不能与以上两种技术相比,但其在研究非定形、不对称和不具全同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的重要作用。 冷冻电子断层成像的适用尺度非常广泛,包括从分子水平的蛋白质,到亚细胞水平的细胞器,以至细胞水平的组织结构。它有效地填补了X-射线晶体学、核磁共振以及冷冻电镜单颗粒分析等方法得到的高精度结构和光学显微镜技术得到的低分辨率的细胞整体图像之间的空白。同时,利用冷冻电子断层成像法在获得体外或细胞环境下大复合体或分子机器的纳米精度的三维结构后,嵌入组成这些大复合体或分子机器的各亚单元的通过X-射线晶体学、NMR或单颗粒分析等方法得到的原子分辨率结构,可以得到生理环境下重要分子机器在细胞环境中的三维空间分布以及组装,从而为深入理解这些分子机器的相互作用机理提供重要而有益的信息。因此,电子断层成像技术近年来在冷冻电镜研究领域得到越来越多的关注,也被2002年《科学》杂志评为当年的十大科技突破之一。 1 ct成像结合成像转色法重构三维结构的图像,根据样品的结构直接进入三维 断层扫描技术(tomography)是从一个物体的投影图像重构获得物体内部结构的技术,通过获取同一物体的多个连续角度下的二维投影图来反向重构它的三维结构。与医院中使用的CT扫描类似,简单地说,电子断层扫描技术就是将一个物体(样品)沿着一个与电子束垂直的轴旋转,每旋转一个角度,采集这个物体在相对应方向上的二维投影像,通过对这些二维投影图的处理(相互配准),将不同角度的二维投影图反向重构(如加权背投影等方法),获得样品整体三维结构的技术(图1)。和CT成像转动光源获得不同角度的投影图不同的是,ET的光源(电子束)不转动,通过倾转电子显微镜的样品台来得到所研究样品的不同方向的投影。依据电镜型号和样品杆的不同,样品倾转范围大概在±60~±80度之间。 利用多角度投影的方法重构物体的三维构象的断层扫描技术的理论基础在几十年前已经建立。但早期的数据收集依靠人工完成,且需要处理的数据量相对于当时的计算机处理能力而言也很庞大,因此相关工作的进展较少。近年来,随着计算机硬件的高速发展和数据处理能力的大大增强,特别是电子显微镜的更新换代以及断层成像数据的自动收集硬件和软件方面的改良,使得电子断层成像研究,尤其是冷冻电子断层成像研究,取得了极大的发展,也正在成为冷冻电镜研究中一个越来越活跃的研究领域。 1.1 样品制备 1.1.1 电子束的物