免疫组化及PCR操作流程.docxVIP

细胞免疫组化步骤PBS冲洗两次丙酮固定10min浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O20.05ml+PBS2ml)37°C30minPBS振洗2次，每次3min加封闭血清,湿盒内37C30min弃去血清加一抗，37C30~60min(1:2001:150稀释)PBS振洗3次，每次3min加二抗，37C30minPBS振洗3次，每次3min加ABC复合剂,37C30minPBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH7.6)振洗1次，每次3min浸入新鲜底物溶液(DAB50mg+100mlTHB)，在室温下暗处10?20min自来水洗5min染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗逐级脱水，70%1次，95%2次，无水3次每次1min透明，过二甲苯3次，每次1min封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程、仪器设备18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2)水浴锅、试剂PBS缓冲液(pH7.2?7.4)：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0，1000ml)：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。 0.5mol/LEDTA缓冲液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10mmol/LNaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0?9.5)等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。 TBS/PBSpH9.0?9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0?7.4适合于光学显微镜标本。 、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60C恒温箱中烘烤20分钟。 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；无水乙醇中浸泡5分钟；95%乙醇中浸泡5分钟；70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0九盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95^左右，放入组织芯片加热10?15分钟。 （3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5?10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin,ChromograninA，Cyclin，ER，Heatshockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53,p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseH等。 2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37^，切片也预热至37r，消化时间约为5?30分钟；胃蛋白酶消化37^时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2?3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2?3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗2?3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加I抗50gl，室温静置1小时或者4°C过夜或者37°C1小时。 9）4C过夜后需在37C复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加H抗40?50叫，室温静置，或37C1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5?10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒