Tn5转座子及其在生物技术领域的应用.docxVIP

? ? Tn5转座子及其在生物技术领域的应用 ? ? 高畅,任鹏程,李明格,吕赫喆,胡仪 (1. 北京师范大学生命科学学院,北京 100875;2. 中国科学院动物研究所,北京 100101) 1 Tn5转座子及转座机制 1.1 Tn5转座子 Tn5是一种复合型转座子,其中心序列可表达3种抗生素(kanr、strr、bleor),两侧为高度同源的倒置序列IS50R和IS50L[1](图1A)。IS50R可以表达产生转座酶(transposase,Tnp)和抑制转座酶活性的抑制蛋白(inhibitor,Inh),IS50L表达产生两个非活性蛋白[2-3]。每个IS50序列都位于两个19 bp的倒置末端(外末端outside end,OE和内末端inside end,IE)之间。倒置末端为转座酶的作用位点,但OE和IE在序列上略有不同[1,4]。后续的研究发现,转座的发生只需其中的关键成分,即转座酶和两个19 bp的倒置末端,内部可以包含任何足够长的DNA片段(图1B)。并且,这两个19 bp的末端可以是倒置的OE和IE、两个OE、两个IE,也可以是两个马赛克末端(mosaic end,ME)。实际上,ME是一种人工构建的末端,其序列与OE存在3个碱基对的不同,且具有比OE和IE更高的转座速率[5]。 图1 Tn5转座子结构Note. A. Traditional transposon Tn5. It contains two inverted versions of IS50 (IS50L and IS50R) bracketing three antibiotic resistance genes (kanr, strr, bleor), and the IS50 elements are defined by the outside end (OE) and inside end (IE). IS50L encodes two inactive proteins, while IS50R encodes transposase (Tnp) and an inhibitor of transposition (Inh). B. Simplified transposon Tn5. Two outside ends (OE) or other ends (IE, ME) brackets sufficient DNA.Figure 1 Structure of transposon Tn5 1.2 转座酶结构 由IS50R编码的Tn5转座酶可以分成3个结构域:与转座子末端DNA结合的N端结构域、具有催化活性的中部结构域和负责蛋白质结合的C端结构域。N端结构域的二级结构仅包含α-螺旋和转角,用于与转座子末端序列的识别和结合;C端结构域也仅有α-螺旋和转角,可以与转座酶结合促进转座过程,也可以同Inh结合形成二聚体抑制转座[6]。而转座酶的活性位点则位于由约300个氨基酸残基组成的中部结构域内,该结构域内含有一个“核酸酶类H模体”起催化作用,且该模体在所有转座酶和逆转录病毒整合酶中都起类似的作用[6-8]。Tn5转座酶的“核酸酶类H模体”活性中心内有D97、D188、E326作为保守的氨基酸残基组成DDE模体,对转座酶的活性有至关重要的作用。该DDE模体与两个Mn2+结合,两个Mn2+分别与OE末端的3’-OH和5’-P配位作为催化活性中心[6]。此外,在DDE模体的谷氨酸残基后还存在一对保守的赖氨酸残基(E×××K××K),其中,第二个赖氨酸残基与Y319、R322及DDE模体中的E326组成了高度保守的YREK模体,该模体使得非转移链的5’-P发生位移,为靶DNA的结合留下了空间[9]。 1.3 Tn5转座机制 Tn5转座需要多个步骤,主要包括转座酶二聚体的形成、供体DNA的切割、靶DNA的捕获与链转移、链转移复合物的脱离4个步骤(见图2)。首先,在缓冲液中加入Mg2+,两个转座酶分子的N端26~65位氨基酸残基及活性中心的几个氨基酸残基与Tn5转座子末端序列特异性结合,构成两个转座酶-DNA复合体[6,10]。紧接着,这两个复合体利用转座酶C端α螺旋交叉,发生剪刀状二聚化,形成一个转座酶二聚体[6-7]。在形成转座酶二聚体后,转座酶启动DNA的切割,并且,一侧的转座酶催化另一侧末端的反应,呈现出交叉作用的现象[11]。整个催化反应大致包括3个步骤:首先,转座酶活化的水分子与DNA链反应,使OE末端暴露出游离的3’-OH;其在接下来的反应中与互补链形成发夹结构,使转座子DNA从供体DNA骨架中脱离;最后,另一活化的水分子将该发夹结构打开,释放出3’-OH为链转移做准备[12]。在整个催化反应完成后,转座酶二聚体捕获靶DN